Eine kleine RNA von Pseudomonas aeruginosa reguliert chronische und akute Infektionen

Jul 15, 2023

Nature Band 618, Seiten 358–364 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Fähigkeit, zwischen verschiedenen Lebensstilen zu wechseln, ermöglicht es bakteriellen Krankheitserregern, in verschiedenen ökologischen Nischen zu gedeihen1,2. Es fehlt jedoch ein molekulares Verständnis ihrer Lebensstilveränderungen im menschlichen Wirt. Hier entdecken wir durch direkte Untersuchung der bakteriellen Genexpression in von Menschen stammenden Proben ein Gen, das den Übergang zwischen chronischer und akuter Infektion im opportunistischen Erreger Pseudomonas aeruginosa orchestriert. Das Expressionsniveau dieses Gens, hier sicX genannt, ist das höchste der P. aeruginosa-Gene, die bei chronischen Wund- und Mukoviszidose-Infektionen beim Menschen exprimiert werden, während des normalen Laborwachstums wird es jedoch auf extrem niedrigem Niveau exprimiert. Wir zeigen, dass sicX eine kleine RNA kodiert, die durch sauerstoffarme Bedingungen stark induziert wird und posttranskriptionell die anaerobe Ubiquinon-Biosynthese reguliert. Die Löschung von sicX führt dazu, dass P. aeruginosa in mehreren Infektionsmodellen bei Säugetieren von einem chronischen zu einem akuten Lebensstil wechselt. Insbesondere ist sicX auch ein Biomarker für diesen Übergang vom chronischen zum akuten Zustand, da es das am stärksten herunterregulierte Gen ist, wenn eine chronische Infektion zu einer akuten Septikämie führt. Diese Arbeit löst eine jahrzehntealte Frage bezüglich der molekularen Basis, die dem Wechsel von chronisch zu akut bei P. aeruginosa zugrunde liegt, und legt nahe, dass Sauerstoff ein primärer Umweltfaktor für akute Letalität ist.

Viele pathogene Bakterien können ihre Wirte besiedeln und chronisch persistieren. In einigen Fällen breiten sich Bakterien von den ursprünglichen Infektionsherden auf andere Körperteile aus, was zu akuten systemischen Erkrankungen führt. Eine zentrale Frage in der Biologie besteht darin, die molekularen Mechanismen und Umwelteinflüsse zu verstehen, die diesen Lebensstilwechsel steuern. Der opportunistische Humanpathogen P. aeruginosa kann sowohl akute als auch chronische Infektionen verursachen, die bekanntermaßen schwer zu behandeln sind. P. aeruginosa liegt als einzelne Zellen (planktonischer Lebensstil) oder in Matrix-umschlossener Aggregate (Biofilm-Lebensstil) vor, von denen man annimmt, dass sie akute bzw. chronische Infektionen begünstigen. Daher konzentrierten sich Laborstudien traditionell auf die Untersuchung des Biofilm-Plankton-Übergangs von P. aeruginosa in vitro mit dem Ziel, die Lebensstiländerungen dieses Krankheitserregers beim Menschen zu verstehen. Jahrzehntelange Arbeit hat gezeigt, wie globale Regulierungssysteme wie das zyklische Second-Messenger-Di-GMP3,4,5 und das Gac-Rsm-System2,6,7,8,9,10,11,12 den Biofilm-Plankton-Übergang von P steuern . aeruginosa in vitro und lieferte wichtige Einblicke in die Lebensgeschichte dieses Bakteriums. Bisher ist jedoch unklar, wie P. aeruginosa auf Umwelteinflüsse reagiert und dementsprechend den Infektionslebensstil im Säugetierwirt verändert. In dieser Studie haben wir diese Wissenslücke geschlossen, indem wir P. aeruginosa-Transkriptome aus menschlichen Proben genutzt haben, um eine neue kleine RNA zu entdecken und mechanistisch zu charakterisieren, die als sRNA-Induktor der chronischen Infektion X (SicX) bezeichnet wird und die chronische P. aeruginosa-Infektion steuert oder akute Entscheidung während einer Säugetierinfektion.

Wir haben zuvor hochauflösende P. aeruginosa-Transkriptome aus menschlichen Infektionsproben erhalten, darunter Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose und Debridementproben von Patienten mit chronischen Wunden13,14. Mithilfe maschineller Lernmethoden haben wir 30 P. aeruginosa-Gene identifiziert, deren Expressionsniveaus das Wachstum von P. aeruginosa beim Menschen insgesamt von dem im Labor unterscheiden13. Mehr als die Hälfte dieser Gene ist nicht charakterisiert, was auf eine erhebliche Lücke im Wissen über die Infektionsbiologie von P. aeruginosa beim Menschen hinweist. Zu diesen Genen mit unbekannter Funktion gehört PA1414 (Locus-Tag im P. aeruginosa-Stamm PAO1), dessen Expressionsniveau beim Menschen 222-fach höher war als im Labor und sein Expressionsniveau ist das höchste der exprimierten P. aeruginosa-Gene während einer menschlichen Infektion (Abb. 1a). Als nächstes verglichen wir die relative Häufigkeit (Transkripte pro Million (TPM)) von PA1414-Transkripten mit denen anderer Protein-kodierender (5.893 Gene) und nicht-kodierender (199 sRNAs)15-Transkripte (Abb. 1b). Im Durchschnitt machten PA1414-Transkripte 13,85 % des TPM in P. aeruginosa-Transkriptomen aus, die aus menschlichen Proben chronischer Infektionen gewonnen wurden, und insbesondere machten sie in einigen Fällen fast 50 % des gesamten TPM aus. Allerdings war das Ausmaß der PA1414-Expression in P. aeruginosa, das unter Standard-In-vitro-Bedingungen gezüchtet wurde, äußerst niedrig. PA1414 ist ein kleines Gen (234 Basenpaare lang) mit unbekannter Funktion. Bei der Untersuchung von 261 vollständigen P. aeruginosa-Genomen wurden 258 PA1414-Orthologe identifiziert (Abb. 1c und erweiterte Daten, Abb. 1), und bei anderen Pseudomonas-Arten oder anderen Organismen wurden keine Homologen identifiziert. Die DNA-Sequenzen von PA1414-Orthologen einschließlich ihrer vorgeschalteten Promotorregionen sind hoch konserviert (Abb. 1d), was darauf hindeutet, dass PA1414 eine konservierte Funktion hat und die Regulierung seiner Expression bei allen P. aeruginosa-Isolaten universell ist.

a, Differenzielle Genexpression von P. aeruginosa zwischen menschlichen Infektionen und häufigen In-vitro-Erkrankungen. Für jedes Gen wird die log2[fache Änderung] gegen den P-Wert des Wald-Tests aufgetragen. Blasen mit schwarzem Rand heben die 30 Signaturgene der menschlichen Infektion mit P. aeruginosa hervor. Die Blasengröße zeigt die mRNA-Read-Häufigkeit bei menschlichen Infektionen an. Blaue Balken auf der Y-Achse zeigen Gene (mit negativen log2-Werten) außerhalb des Skalenbereichs an. Gestrichelte graue Linien zeigen die Grenzwerte (−log10[angepasster P-Wert] > 2, |log2[fold change]| > 1) zur Identifizierung unterschiedlich exprimierter Gene an. Die hochregulierten (grün) und herunterregulierten (blau) Gene beim Menschen sind unterschiedlich farblich gekennzeichnet. Graue Blasen zeigen Gene an, die nicht unterschiedlich exprimiert werden. b, Relative Transkripthäufigkeit (TPM) von PA1414 im Vergleich zu denen aller anderen proteinkodierenden Sequenzen (CDSs) und nichtkodierenden sRNAs in 54 in a untersuchten Transkriptomen, sortiert vom höchsten zum niedrigsten PA1414-TPM. Der durchschnittliche PA1414-TPM ist mit gestrichelten Linien dargestellt. c, PA1414-Orthologe kommen nur in P. aeruginosa vor. Grüne und schwarze Balken zeigen das Vorhandensein bzw. Fehlen von Orthologen an. d, DNA-Sequenzkonservierung von PA1414 und seinen Nachbargenen unter 258 PA1414-haltigen P. aeruginosa-Isolaten. Unten ist der Prozentsatz der Orthologen, die mit dem PA1414-Allel von PA14 an jedem Nukleotid identisch sind, dargestellt.

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P. aeruginosa kann in verschiedenen ökologischen Nischen im menschlichen Körper gedeihen. Um zu verstehen, welche Umwelteinflüsse die PA1414-Expression beeinflussen, haben wir 202 öffentlich verfügbare P. aeruginosa-Transkriptome untersucht, die in verschiedenen Umgebungen erfasst wurden (Abb. 2a und Ergänzungstabelle 1). Wir fanden heraus, dass PA1414 unter sauerstoffarmen und anaeroben Bedingungen in hohen Mengen exprimiert wurde. In Übereinstimmung mit diesem Befund zeigte eine frühe Microarray-Studie auch, dass PA1414 während des anaeroben Wachstums induziert wird16. Darüber hinaus wurde stromaufwärts von PA1414 ein Konsensbindungsmotiv für den globalen anaeroben Transkriptionsregulator Anr16 identifiziert (Extended Data Abb. 2a). Unter Verwendung eines lacZ-Reporters, der die Transkription von PA1414 quantifiziert, zeigten wir, dass dieses Gen unter anaeroben Bedingungen tatsächlich um das 25-fache induziert wurde und die Mutagenese von Anr oder dem Bindungsmotiv die PA1414-Expression aufhob (Abb. 2b). PA1414 wurde auch bei statischer Kultivierung in einem etwa 18-fach höheren Ausmaß exprimiert (Abb. 2b), was darauf hinweist, dass für seine Induktion keine strengen anaeroben Bedingungen erforderlich sind. Darüber hinaus lieferte die Northern-Blot-Analyse direkte Beweise dafür, dass PA1414-Transkripte während des anaeroben, aber nicht des aeroben Wachstums in großer Zahl vorhanden waren (Abb. 2c). Um die PA1414-Expressionsniveaus beim Menschen und in sauerstoffarmen Umgebungen direkt zu vergleichen, führten wir RNA-Sequenzierungsexperimente (RNA-seq) an P. aeruginosa während des statischen In-vitro-Wachstums (bei sauerstoffarmen Bedingungen) durch und folgten dabei der gleichen Bibliotheksvorbereitungsmethode in unserer Studie über P. aeruginosa-Transkriptome beim Menschen14. Wir fanden heraus, dass die PA1414-Transkripthäufigkeit (TPM) unter sauerstoffarmen Bedingungen zwar siebenmal geringer war als bei menschlichen Infektionen, PA1414 jedoch zu den drei Genen gehört, die am höchsten exprimiert werden (von etwa 6.000 Protein-kodierenden und sRNA-Genen), was dies unterstützt Annahme, dass ein niedriger Sauerstoffgehalt tatsächlich ein Hauptgrund für sein hohes Expressionsniveau ist (Erweiterte Daten, Abb. 2b). Angesichts der Tatsache, dass P. aeruginosa bei chronischen Infektionen des Menschen häufig auf Umgebungen mit niedrigem Sauerstoffgehalt trifft17,18, deuten diese Daten darauf hin, dass P. aeruginosa auf diesen Umweltreiz des Wirts reagiert, indem es das Expressionsniveau von PA1414 erhöht.

a, PA1414-RNA-Häufigkeit (TPM) und die entsprechende Rangfolge (aus allen proteinkodierenden Genen und sRNAs) in 202 P. aeruginosa-Transkriptomen. Gestrichelte Linien zeigen die Grenzwerte (PA1414 TPM > 103, PA1414-Ranking < 102) zur Identifizierung von Transkriptomen mit hoher PA1414-Expression. b, β-Galactosidase-Assay zur Untersuchung der Induktion von PA1414 unter anaeroben und statischen Bedingungen. PPA1414-lacZ, lacZ transkriptionell an den PA1414-Promotor fusioniert; PPA1414*, PA1414-Promotor, der Mutationen im Anr-Bindungsmotiv enthält; MrT7, MAR2xT7-Transposon. n ≥ 4 unabhängige Experimente. c: Northern-Blot-Analyse der PA1414-Expression. Die geschätzte Größe (Nukleotide, nt) ist links angegeben. Als Ladekontrolle diente 5S-rRNA. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. d, Kolonie-Biofilmwachstum von ΔPA1414 und WT in verschiedenen P. aeruginosa-Stammhintergründen. Die Anwesenheit und Abwesenheit von Sauerstoff wird angezeigt. Die KBE von ΔPA1414 wurde in jedem Experiment gegen die KBE des WT normalisiert (n = 4). Eine gestrichelte Linie markiert den Punkt, an dem das CFU-Verhältnis = 1 ist. e, Prozentsatz der Tetracyclin-resistenten (TetR) Zellen vor und nach täglichen Passagen unter anaeroben Bedingungen (n = 3). TetS, Tetracyclin-sensitiv; Δ, ΔPA1414. f, RNA-seq-Reads, die während des Standard-In-vitro-Wachstums und bei menschlichen Infektionen auf den PA1414-Locus ausgerichtet sind. Der blaue Farbton weist auf einen Rho-unabhängigen Terminator in PA1414 hin. g, Koloniebiofilmwachstum von ΔsicX, das verschiedene sicX-Mutationen unter anaeroben Bedingungen beherbergt. n = 4 unabhängige Experimente. h, Eine vergleichende proteomische Studie identifiziert die Ziele von SicX sowohl unter statischen als auch unter anaeroben Bedingungen. i, β-Galactosidase-Assay zur Bewertung der Translationskontrolle von SicX auf ubiUVT unter anaeroben Bedingungen (n ≥ 4). j, β-Galactosidase-Assay zur Bewertung der Transkription von ubiUVT in Abwesenheit von SicX oder Anr unter statischen Bedingungen (n ≥ 8). k, Quantifizierung der anaeroben UQ9-Synthese in verschiedenen Stämmen (n = 4). l, Ein Modell der dualen Regulierung der ubiUVT-Expression durch Anr und SicX. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. Signifikante Unterschiede (im Vergleich zum WT) sind mit Sternchen (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; zweiseitiger Mann-Whitney-Test) gekennzeichnet.

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Als nächstes haben wir untersucht, ob PA1414 die anaerobe Physiologie von P. aeruginosa beeinflusst. Für diese Experimente haben wir PA1414 aus dem P. aeruginosa-Stamm PA14 gelöscht (das entsprechende Locus-Tag in diesem Stamm ist PA14_46160) und das Wachstum von ΔPA1414 mit dem von Wildtyp (WT) P. aeruginosa unter aeroben und anaeroben Bedingungen verglichen (Abb . 2d). Mithilfe eines Kolonie-Biofilm-Assays stellten wir fest, dass sich die Deletion von PA1414 zwar nicht negativ auf das aerobe Wachstum von P. aeruginosa auswirkte, ΔPA1414 jedoch unter anaeroben Bedingungen mit Nitrat als alternativem Elektronenakzeptor Wachstumsausbeuten aufwies, die etwa halb so hoch waren wie die von WT (Abb. 2d). Ähnliche Beobachtungen wurden bei verschiedenen Hintergründen von P. aeruginosa-Stämmen gemacht, einschließlich eines klinischen Mukoviszidose-Isolats, B1 (Abb. 2d; Lit. 19). Obwohl wir gezeigt haben, dass PA1414 auch eine untergeordnete Rolle beim anaeroben Planktonwachstum spielt (Extended Data, Abb. 2c), zeigten Konkurrenzexperimente, bei denen WT und ΔPA1414 gemeinsam planktonisch kultiviert wurden (im Ausgangsverhältnis 1:1) und täglich unter anaeroben Bedingungen passagiert wurden dass WT ΔPA1414 nach Tag 3 übertraf (Abb. 2e).

Als nächstes untersuchten wir den molekularen Mechanismus, durch den PA1414 das anaerobe Wachstum steuert. Obwohl als Protein-kodierendes Gen bezeichnet, entdeckten wir, dass PA1414-Transkripte während einer menschlichen Infektion auf das 5'-Ende beschränkt waren (Abb. 2f) und ein ähnliches Muster auch unter anaeroben Bedingungen beobachtet wurde (Extended Data Abb. 2d). Die deutliche Anreicherung kurzer Transkripte, die das annotierte Startcodon umfassen, warf die Frage auf, ob PA1414 ein funktionelles Protein oder eine kleine regulatorische RNA (sRNA) kodiert. Um diese Frage zu beantworten, haben wir verschiedene Mutationen in PA1414 eingeführt und untersucht, ob sie den Wachstumsausbeutedefekt des ΔPA1414-Kolonie-Biofilms unter anaeroben Bedingungen wiederherstellen können (Abb. 2g und erweiterte Daten Abb. 2e). Wir fanden heraus, dass eine Startcodon- oder Frame-Shift-Mutation (zur Verhinderung der Proteinsynthese) die Funktion von PA1414 nicht beeinträchtigte, wohingegen synonyme Substitutionen in der stark transkribierten Region (zur Störung potenzieller Wechselwirkungen von sRNA mit Ziel-mRNAs oder RNA-bindenden Proteinen) aufgehoben wurden seine Funktion. Darüber hinaus reichte ein verkürztes Allel, das nur die stark transkribierte 5'-Region umfasste, aus, um den anaeroben Wachstumsdefekt in ΔPA1414 wiederherzustellen, was diese funktionelle Region von PA1414 weiter hervorhebt. Durch Northern-Blot-Analysen haben wir gezeigt, dass die beobachteten Wachstumsunterschiede nicht auf die unterschiedliche sRNA-Häufigkeit zurückzuführen sind (Extended Data, Abb. 2f). Daraus schließen wir, dass PA1414 als sRNA (im Folgenden als SicX bezeichnet) fungiert, die für das anaerobe Wachstum von P. aeruginosa in vitro nicht essentiell ist, diese aber fördert.

Da sRNAs ihre Regulation häufig posttranskriptionell ausüben20,21,22, führten wir quantitative Shotgun-Proteomik durch, um Ziele von SicX zu identifizieren. Hier wurden Proteome von WT P. aeruginosa und ΔsicX unter zwei Wachstumsbedingungen erhalten, bei denen sicX in hohem Maße exprimiert wird: sauerstoffarmes (statisches Wachstum) und streng anaerobe Bedingungen. Wir identifizierten sieben Proteine ​​(darunter drei mit bekannten Funktionen), die unter beiden Wachstumsbedingungen unterschiedliche Häufigkeiten zwischen WT und ΔsicX aufwiesen (Abb. 2h und Ergänzungstabelle 2). Eines dieser Proteine ​​ist UbiV, das vom ubiUVT-Operon23 kodiert wird. Dieses Operon kodiert Proteine, die für die anaerobe Biosynthese von Ubiquinon verantwortlich sind, einem essentiellen Elektronenträger für den Atmungsstoffwechsel in Proteobakterien23. Obwohl die beiden anderen von diesem Operon kodierten Proteine, UbiU und UbiT, nicht zu den sieben Proteinen gehörten, die mit unseren strengen Kriterien identifiziert wurden, ergaben weitere Untersuchungen, dass beide Proteine ​​im Vergleich zu WT P. aeruginosa während des statischen Wachstums ebenfalls signifikant verringerte ΔsicX-Werte aufwiesen (Ergänzungstabelle 2). Unter Verwendung eines lacZ-Translationsreporters des ubiUVT-Operons haben wir gezeigt, dass die Deletion von sicX die Translationsaktivität von ubiUVT unter anaeroben Bedingungen tatsächlich um das Sechsfache reduzierte und die genetische Komplementierung mit sicX in trans die ubiUVT-Translation wiederherstellte (Abb. 2i). Darüber hinaus hatte SicX keinen Einfluss auf die Transkription von ubiUVT (Abb. 2j). Um einen direkten Beweis dafür zu liefern, wie SicX die anaerobe Atmung reguliert, haben wir die Häufigkeit von Ubiquinon (genauer gesagt UQ9) in WT und ΔsicX unter anaeroben Bedingungen durch Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie quantifiziert. Tatsächlich zeigte ΔsicX eine zweifache Reduzierung von UQ9 im Vergleich zu WT ( Abb. 2k). Daher kamen wir zu dem Schluss, dass SicX posttranskriptionell die Expression von UbiUVT induziert. Unser Befund liefert auch Einblicke in die erhöhte Häufigkeit von Dnr und HemF in ΔsicX (Abb. 2h), da Dnr den Denitrifikationsweg16 induzieren kann, um den anaeroben Stress in ΔsicX zu lindern, und die Expression von HemF Dnr-abhängig ist24. Insbesondere stellten wir fest, dass die Transkription von ubiUVT unter der Kontrolle von Anr steht (Abb. 2j). Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse ein Modell, in dem Anr die Transkription von sicX und ubiUVT als Reaktion auf Sauerstoffmangel aktiviert. Im Gegenzug induziert SicX posttranskriptionell die Ubiquinon-Biosynthese, um die anaerobe Physiologie von P. aeruginosa zu formen (Abb. 2l).

Als nächstes untersuchten wir, wie SicX die Translation von ubiUVT-mRNA aktiviert. In-silico-Analyse durch IntaRNA25 identifizierte eine mutmaßliche Basenpaarungswechselwirkung zwischen SicX und der 5'-untranslatierten Region (UTR) des ubiUVT-Operons (Extended Data Abb. 3a). Mit Mfold26 vorhergesagte Sekundärstrukturen deuten darauf hin, dass eine Stamm-Schleife innerhalb der 5′-UTR von ubiUVT die Ribosomenbindungsstelle von ubiU verschließt, wohingegen eine Basenpaarung mit SicX das Potenzial hat, die Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiierung freizugeben. Um dies experimentell zu testen, führten wir umfangreiche Mutationsanalysen von sicX und der 5'-UTR von ubiUVT durch und das funktionelle Ergebnis jeder Punktmutation (insgesamt 37) wurde durch einen lacZ-Reporter bewertet, der translatorisch mit ubiUVT fusioniert war (Extended Data Abb. 3a). ,B). In Übereinstimmung mit der In-silico-Vorhersage identifizierten wir Mutationen innerhalb der SicX-Seed-Region (für die Basenpaarung mit der ubiUVT-mRNA) und der Zielregion in der 5'-UTR von ubiUVT, die zu einer verringerten translatorischen Aktivierung von ubiUVT führten, wohingegen Mutationen in anderen Regionen im Allgemeinen auftraten hatte nur begrenzte Auswirkungen (Extended Data Abb. 3a,b). Darüber hinaus kann eine Punktmutation in der Samenregion von SicX, die die ubiUVT-Translation verringerte, teilweise wiederhergestellt werden, indem die Basenpaarung in der 5'-UTR von ubiUVT wiederhergestellt wird (Extended Data, Abb. 3b). Es ist jedoch zu beachten, dass die beobachtete Translationswiederherstellung teilweise auf die Mutation in der 5'-UTR von ubiUVT zurückzuführen ist, die die ubiUVT-Translation auch in Abwesenheit von SicX erhöhte (Extended Data Abb. 3c), wahrscheinlich durch Destabilisierung der Stammschleife . Schließlich haben wir gezeigt, dass das RNA-Chaperon Hfq27 für die Induktion der ubiUVT-Translation durch SicX nicht erforderlich ist (Extended Data Abb. 3d). Obwohl bekannt ist, dass Hfq in vielen Fällen die Wechselwirkungen zwischen sRNAs und Ziel-mRNAs erleichtert, sind Hfq-unabhängige sRNA-mRNA-Wechselwirkungen gut dokumentiert28,29,30. Auf der Grundlage unserer genetischen Ergebnisse schlagen wir ein Hfq-unabhängiges Basenpaarungsmodell für die SicX-Stimulation der ubiUVT-Translation vor, das in Zukunft getestet wird. Bemerkenswert ist, dass die vorhergesagten Basenpaarungsregionen in SicX und der 5'-UTR von ubiUVT in allen untersuchten P. aeruginosa-Genomen identisch sind (Extended Data Abb. 4a – c), und daher könnte dieser Regulationsmechanismus in P. aeruginosa universell sein.

Obwohl wir mittlerweile über ein detaillierteres Verständnis der SicX-Funktion in vitro verfügen, bleibt unbekannt, wie SicX die Pathogenese von P. aeruginosa beeinflusst. Hier haben wir diese Frage beantwortet, indem wir WT P. aeruginosa und ΔsicX in ein Mausmodell für chronische Wunden eingeführt haben (Abb. 3a). Dieses Modell wurde ausgewählt, weil quantitativ gezeigt wurde, dass es die P. aeruginosa-Genexpression bei chronischen Infektionen des Menschen genau rekapituliert13, und SicX-sRNA in diesem Modell ähnlich wie beim Menschen exprimiert wird (Abb. 2a und erweiterte Daten Abb. 5a, b). Das Modell beinhaltet die Infektion chirurgisch erzeugter Rückenwunden voller Dicke31 (Abb. 3a). Es handelt sich um ein chronisches, nicht tödliches Modell, da P. aeruginosa im Allgemeinen wochenlang an der Infektionsstelle verbleibt, ohne eine systemische Verbreitung zu verursachen. Zehn Tage nach der Infektion beurteilten wir die Bakterienbelastung im Wundgewebe sowie die Verbreitung in der Milz. In Wundgeweben waren die Bakterienkonzentrationen zwischen WT P. aeruginosa und ΔsicX ähnlich (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass das Fehlen von SicX keinen Einfluss auf die Kolonisierung hat. Während jedoch nur 2 von 21 WT-infizierten Mäusen eine Verbreitung in der Milz zeigten, zeigten 12 von 20 ΔsicX-infizierten Mäusen eine systemische Verbreitung (zweiseitiger Fisher-Test, P = 0,0009; Abb. 3c). Darüber hinaus verursachte ΔsicX eine höhere Letalität (Abb. 3d), was bei WT P. aeruginosa in diesem Modell nicht häufig beobachtet wird. Die Verbreitung erfolgte im Allgemeinen, wenn die Wundlast hoch war (>108 koloniebildende Einheiten (KBE) g−1; Abb. 3c). Allerdings verursachte ΔsicX bei Mäusen mit einer hohen Wundlast (>108 KBE g−1) mehr systemische Infektionen (12 von 15) als WT (2 von 11), was darauf hindeutet, dass die Verbreitung nicht ausschließlich von der Wundlast abhing (zweiseitiger exakter Fisher-Test, P = 0,0043; Abb. 3c). Darüber hinaus sind diese Beobachtungen nicht auf die unterschiedliche Fitness von WT und ΔsicX in der Milz zurückzuführen. Dies wurde anhand eines akuten Hautinfektionsmodells gezeigt, bei dem eine systemische Infektion kurz nach der subkutanen Injektion in den inneren Oberschenkel der Maus auftritt. In diesem Modell zeigten WT und ΔsicX eine ähnliche Besiedlung und ein ähnliches Wachstum in der Milz (Extended Data Abb. 6). Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass SicX eine Schlüsselrolle bei der chronischen Infektion mit P. aeruginosa spielt, deren hohe Expression chronische lokalisierte Infektionen fördert.

a, Schematische Darstellung des chronischen Wundmodells der Maus (10-Tage-Infektion). b, P. aeruginosa-Belastung in Wunden. Linien geben Mittel an. c, P. aeruginosa-Belastung in der Milz (y-Achse). Auf der x-Achse ist die entsprechende Wundlast angegeben. d, Überlebenskurven von Mäusen, die mit WT (n = 24) und ΔsicX (n = 24) infiziert waren. e: Die Wiederherstellung der ubiUVT-Translation in ΔsicX verhinderte die Verbreitung und die Löschung von ubiUVT in WT verursachte die Verbreitung. f, räumliche Organisation von P. aeruginosa in Wunden. C, Kern; E, Kante. g, Schematische Darstellung des Maus-Pneumoniemodells (2-Tage-Infektion). h, P. aeruginosa-Belastung in der Lunge. Linien geben Mittel an. Ich, P. aeruginosa Belastung in der Milz. Linien geben Mittel an. Der zweiseitige Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um die Unterschiede in der Bakterienbelastung in b, c, h, i zu vergleichen. Für d bzw. f wurden der Log-Rank-Test und der zweiseitige Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Test verwendet. Zusammenfassung von n = 6 unabhängigen Experimenten für b–d; n = 3 unabhängige Experimente für e,f; n = 2 unabhängige Experimente für h,i. NS, nicht signifikant.

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Um festzustellen, ob die erhöhte Verbreitung und Letalität der ΔsicX-Infektion mit einer verringerten anaeroben Ubiquinon-Produktion zusammenhängt, haben wir zunächst die Translation von ubiUVT von SicX entkoppelt, indem wir einen P. aeruginosa-Stamm (ΔsicX-ubiC) erstellt haben, der UbiUVT konstitutiv übersetzt, auch wenn es nicht vorhanden ist SicX (Erweiterte Daten Abb. 7a,b). Dies wurde durch die Einführung von Punktmutationen in die 5′-UTR von ubiUVT erreicht, die wahrscheinlich seine Sekundärstruktur verändern und eine aktive Translation ermöglichen. ΔsicX-ubiC wuchs unter anaeroben Bedingungen in vitro zu ähnlichen Erträgen wie WT P. aeruginosa und deutlich höheren Erträgen als ΔsicX (Extended Data Abb. 7c), und dies war auf die Wiederherstellung der anaeroben Ubichinonsynthese zurückzuführen (Abb. 2k). ). Als nächstes stellten wir unter Verwendung des Mausmodells für chronische Wunden fest, dass ΔsicX-ubiC keine systemische Verbreitung aufwies (Abb. 3e). Wir haben auch das ubiUVT-Operon aus WT P. aeruginosa gelöscht, und der resultierende Stamm wuchs aufgrund des Defekts in der anaeroben Ubiquinon-Synthese nicht anaerob (Extended Data Abb. 7d). Obwohl alle Stämme eine ähnliche Bakterienbelastung in der Wunde aufwiesen (Extended Data Abb. 5c), wurde eine systemische Verbreitung nur bei ΔsicX- und ΔubiUVT-Infektionen beobachtet (Abb. 3e), was darauf hindeutet, dass eine ausreichende anaerobe Ubiquinonsynthese zu einer chronischen lokalisierten Infektion beiträgt. Obwohl der Mechanismus, wie die Ubiquinon-Häufigkeit den Infektionslebensstil beeinflusst, unklar ist, haben wir festgestellt, dass es die räumliche Verteilung von P. aeruginosa-Zellen im Makromaßstab in der Wunde beeinflusst: WT-Zellen blieben bevorzugt im Wundzentrum, wo die Zellen ursprünglich inokuliert wurden, und wurden mit ΔsicX infiziert Wunden enthielten äquivalente Zellen in der Mitte und an den Außenrändern der Wunden (Abb. 3f). Dies wird durch unsere proteomischen Ergebnisse gestützt, die zeigen, dass ΔsicX erhöhte Konzentrationen von zwei Proteinen (kodiert durch PA0223 und PA0224) aufwies, die Biomarker von dispergiertem P. aeruginosa32 sind (Ergänzungstabelle 2). Darüber hinaus zeigte ΔubiUVT ein ähnliches räumliches Organisationsmuster wie ΔsicX (Abb. 3f). In Anbetracht der Tatsache, dass die Wunde wahrscheinlich Sauerstoffgradienten aufweist, spekulieren wir, dass diese unterschiedlichen räumlichen Verteilungen teilweise die unterschiedliche Sauerstoffverfügbarkeit in der Wunde widerspiegeln. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass eine verringerte anaerobe Ubiquinon-Biosynthese die Verbreitung von ΔsicX fördert.

P. aeruginosa ist dafür bekannt, eine Reihe von Lungeninfektionen zu verursachen. Daher haben wir auch die Rolle von SicX bei der Kolonisierung und Verbreitung anhand eines Mauspneumoniemodells untersucht (Abb. 3g). Hierbei etabliert P. aeruginosa nach intranasaler Verabreichung eine Infektion in der Lunge, die je nach Virulenz einzelner Stämme wiederum zu einer systemischen Verbreitung führen kann. Wir fanden heraus, dass Mäuse, die mit subletalen Dosen von WT und ΔsicX-Varianten von PA14, einem hochvirulenten Stamm, infiziert waren, 48 Stunden nach der Infektion eine ähnliche Bakterienbelastung in der Lunge aufwiesen (Abb. 3h). Im Gegensatz dazu war die bakterielle Belastung in der Milz von ΔsicX-infizierten Mäusen etwa 100-fach höher als die von WT-infizierten Mäusen, und die Komplementierung mit dem verkürzten sicX-Allel (dargestellt in Abb. 2g) führte zu einer verringerten trans-Verbreitung (Abb. 3i). Dies weist darauf hin, dass ein Mangel an SicX eine systemische Infektion fördert. Darüber hinaus haben wir Experimente mit einem anderen Stamm, PAO1, durchgeführt, der weniger akut virulent ist als PA14. Wir fanden heraus, dass WT und ΔsicX eine ähnliche Kolonisierung in der Lunge aufwiesen, und während nur zwei von neun WT-infizierten Mäusen eine Verbreitung in der Milz zeigten, zeigten acht von neun ΔsicX-infizierten Mäusen eine systemische Verbreitung (zweiseitiger Fisher-Test, P = 0,015). ; Erweiterte Daten Abb. 8). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass SicX chronisch lokalisierte Infektionen in mehreren Säugetierinfektionsmodellen fördert.

Da das Vorhandensein oder Fehlen von SicX unterschiedliche Lebensstile bei Infektionen bestimmt, haben wir als Nächstes untersucht, ob sich die SicX-sRNA-Häufigkeit während des Übergangs zwischen chronischen und akuten Infektionen ändert. Um dies zu testen, verwendeten wir das Mausmodell für chronische Wunden, bei dem WT P. aeruginosa zunächst eine lokale Infektion etablieren durfte und dann mit Glykosidhydrolasen (GHs) oder cis-2-Decensäure (cis-DA) behandelt wurde, um eine systemische Verbreitung zu induzieren. ahmt den Übergang vom chronischen zum akuten Zustand nach (Abb. 4a). GHs und cis-DA wurden verwendet, da sie unterschiedliche Mechanismen bieten, die die Ausbreitung von Biofilmen vorantreiben: GHs zielen auf Biofilm-Exopolysaccharide ab, indem sie die glykosidischen Bindungen hydrolysieren, um passiv die Ausbreitung zu induzieren33,34,35, wohingegen cis-DA ein Fettsäure-Signalmolekül ist, das die Ausbreitung aktiv vorantreibt Regulierung der bakteriellen Genexpression und Physiologie36,37,38. Wichtig ist, dass gezeigt wurde, dass die GH-induzierte Biofilmausbreitung in diesem Modell eine tödliche Septikämie verursachen kann35. Hier verglichen wir die Transkriptome von P. aeruginosa vor (d. h. reife Biofilme im Wundgewebe) und nach (d. h. dispergierte Zellen) der Behandlung mit GHs oder cis-DA (Abb. 4b). Funktionelle Anreicherungsanalysen stützen die Annahme, dass GHs und cis-DA während der In-vivo-Verbreitung unterschiedliche physiologische und metabolische Veränderungen hervorriefen (Erweiterte Daten, Abb. 9). Bemerkenswerterweise stellten wir unter den Genen, die als Reaktion auf beide Behandlungen unterschiedlich exprimiert wurden, fest, dass sicX das am stärksten herunterregulierte Gen war (Abb. 4c), was die Annahme stützt, dass sich die SicX-Spiegel während des Übergangs vom chronischen zum akuten Zustand deutlich ändern. Wir fanden auch heraus, dass Gene, die an der Alginatsynthese (algA und algD) und dem Export (algE) beteiligt sind, während der Ausbreitung des Biofilms herunterreguliert wurden (Abb. 4d). Darüber hinaus sind der Denitrifikationsweg (nir-, nar- und Molybdopterin-Cofaktor-Gene als Reaktion auf GHs; nir- und nor-Gene als Reaktion auf cis-DA) und Oxidasen mit hoher Sauerstoffaffinität (Oxidase vom cbb3-Typ als Reaktion sowohl auf GHs als auch cis-DA) betroffen ) wurden herunterreguliert, wohingegen Oxidasen mit niedriger Sauerstoffaffinität (Cyo-Oxidase als Reaktion auf GHs) hochreguliert wurden (Abb. 4d), was auf eine Erhöhung der Sauerstoffverfügbarkeit während der Ausbreitung hinweist. Insgesamt identifizieren unsere Beobachtungen sicX als Biomarker für den Übergang vom chronischen zum akuten Zustand und legen nahe, dass Sauerstoff während dieses Prozesses ein wichtiges Umweltsignal ist.

a, Schematische Darstellung der In-vivo-Ausbreitung reifer Biofilme in chronischen Wunden von Mäusen. b, Venn-Diagramm der Gene, die vor (n = 3 Tieren) und nach der Behandlung mit GH (n = 2) oder cis-DA (n = 2) unterschiedlich exprimiert werden. c, sicX (orange) ist das am häufigsten herunterregulierte Gen unter den 132 unterschiedlich exprimierten Genen, die sowohl unter GH- als auch unter cis-DA-Behandlung identifiziert wurden. d, Wärmekarte von differentiell exprimierten (DE) Genen, die an der Alginatsynthese und -sekretion, der anaeroben Atmung und der aeroben Atmung beteiligt sind. Indiziert sind aerobe terminale Oxidasen mit niedriger oder hoher Sauerstoffaffinität. Leere Zellen weisen auf Gene hin, die nicht als differenziell exprimiert identifiziert wurden. e, Ein Arbeitsmodell dafür, wie SicX es P. aeruginosa ermöglicht, eine chronische lokale Infektion in einer Wirtsumgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt zu etablieren. Fehlendes oder niedriges SicX begünstigt systemische Infektionen.

Quelldaten

Zusammenfassend haben wir durch die Nutzung bakterieller Transkriptome aus menschlichen Infektionen entdeckt, dass P. aeruginosa eine auf Sauerstoff reagierende sRNA, SicX, produziert, deren Häufigkeit den Übergang zwischen chronischen und akuten Infektionen steuert (Abb. 4e). Die Fähigkeit, auf stressige Umgebungen zu reagieren, ist für das Überleben vieler Organismen entscheidend. Dabei spielen sRNAs eine Schlüsselrolle bei der Feinabstimmung der Genexpression. Beispielsweise wird bei einer Salmonelleninfektion die sRNA PinT induziert und reguliert die Genexpression, um den Übergang vom Invasionsstadium zum intrazellulären Überleben zu erleichtern39. In einem anderen Fall unterdrückt Helicobacter pylori die Expression der sRNA HPnc4160 während der Infektion, wodurch Zielgene hochreguliert werden, um die bakterielle Kolonisierung im Wirt zu fördern und möglicherweise das Risiko einer Magenkarzinogenese zu erhöhen40. In dieser Studie liefern wir einen überzeugenden Fall einer sRNA, die wichtige Lebensstilentscheidungen während einer P. aeruginosa-Infektion steuert. Darüber hinaus erweist sich SicX als prognostischer und diagnostischer Biomarker als vielversprechend, da es das am stärksten reagierende Gen während des Übergangs vom chronischen zum akuten Zustand ist.

Obwohl jahrzehntelange In-vitro-Studien wichtige Regulierungssysteme definiert haben, die den Biofilm-Plankton-Übergang in P. aeruginosa steuern, fehlen belastbare Beweise, die ihre Rolle im Säugetierwirt untermauern. Beispielsweise ist die Gac-Rsm-Signalkaskade in vielen Bakterienarten weit verbreitet und moduliert bekanntermaßen die Expression von Merkmalen, die mit der planktonischen oder biofilmischen Lebensweise von P. aeruginosa verbunden sind. Diese Kaskade beruht auf den Wechselwirkungen zwischen globalen posttranskriptionellen Regulatoren (RsmA oder RsmN (auch als RsmF bekannt)) und Rsm-sRNAs, um die Genexpression6 zu optimieren (Extended Data Abb. 10a). Wir fanden jedoch heraus, dass Rsm-sRNAs bei chronisch mit P. aeruginosa infizierten Patienten nur in geringen Mengen exprimiert werden (Extended Data Abb. 10b, c), was darauf hindeutet, dass sie nur minimal an der Aufrechterhaltung einer langfristigen Infektion beteiligt sind. Obwohl Studien gezeigt haben, dass die Inaktivierung spezifischer Komponenten von Gac-Rsm in akuten Infektionsmodellen zu Fitness- oder Kolonisierungsdefekten führte7,41, fehlen weiterhin überzeugende Beweise für ein Modell zur Änderung des Lebensstils während einer Infektion bei Säugetieren. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die Regulierung der SicX-Expression unabhängig vom GacS-GacA-Zweikomponentensystem ist (Extended Data, Abb. 10d). Darüber hinaus weist der in dieser Studie verwendete primäre P. aeruginosa-Stamm (PA14) eine Mutation in ladS auf, einer Sensorkinase, die die GacS-GacA-Aktivität stimuliert und Biofilmeigenschaften fördert42, dennoch etablierte dieser Stamm im chronischen Wundmodell der Maus immer noch eine chronische lokalisierte Infektion (Abb. 3b). Wie viele andere pathogene Bakterien besiedelt P. aeruginosa ein breites Spektrum ökologischer Nischen, einschließlich wirtsfreier Ökosysteme, und daher könnten bestimmte regulatorische Merkmale, die den Biofilm-Plankton-Übergang steuern, unter Bedingungen ausgewählt worden sein, die nichts mit der menschlichen Pathogenese zu tun haben. Unsere Studie bietet somit einen Rahmen für die Entdeckung wichtiger pathogener Merkmale durch die Nutzung bakterieller Genexpressionsinformationen aus menschlichen Infektionen.

Sofern nicht anders angegeben, wurden P. aeruginosa-Zellen routinemäßig in Hirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI) bei 37 °C unter Schütteln (250 U/min) kultiviert. Pseudomonas-Isolationsagar (PIA) wurde zur Selektion von P. aeruginosa gegen andere Mikroben verwendet. Escherichia coli-Zellen wurden in Lysogenie-Brühe kultiviert. Zur Herstellung der Platten wurde 1,5 % (Gew./Vol.) Agar verwendet. Dem Medium wurden nach Bedarf Antibiotika zugesetzt: 60 µg ml-1 Gentamicin, 75 µg ml-1 Tet oder 300 µg ml-1 Carbenicillin für P. aeruginosa; 10 µg ml−1 Gentamicin, 10 µg ml−1 Tet oder 100 µg ml−1 Carbenicillin für E. coli. Für die statische oder anaerobe Kultivierung von P. aeruginosa wurden 50 mM KNO3 zur BHI-Brühe gegeben. Der anaerobe Zustand wurde in einer anaeroben Vinylkammer (Coy Lab Products) mit der folgenden Atmosphäre aufrechterhalten: 85 % N2, 10 % CO2 und 5 % H2.

Die in dieser Studie verwendeten Stämme, Plasmide und Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Um transkriptionelle lacZ-Fusionen (pPC100–102) zu erzeugen, wurden die gewünschten Promotorregionen PCR-amplifiziert (Q5, New England Biolabs) unter Verwendung von genomischer PA14-DNA als Matrize Die resultierenden Amplikons, die überlappende Regionen von etwa 25 Basenpaaren (bp) enthielten, wurden in den Mini-CTX-lacZ-Vektor (linearisiert mit EcoRI und KpnI) in Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) ligiert. Um sicX-Komplementationsplasmide (pPC103–106) zu erstellen, wurden der sicX-Promotor und die sicX-Allele (die Mutationen wie in der Ergänzungstabelle 3 beschrieben enthalten) durch Gibson-Assemblierung in den Mini-CTX1-Vektor (linearisiert mit EcoRI und KpnI) ligiert. Alle sicX-Punktmutationen (pPC107–124) wurden mit dem Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs) unter Verwendung von mini-CTX1-sicXTruncate (pPC106) als Vorlage konstruiert. Um translatorische lacZ-Fusionen (pPC125–126) zu erzeugen, wurde die Promotorregion von ubiU PCR-amplifiziert und dann zwischen den EcoRI- und BamHI-Stellen in pSW205 ligiert. Alle ubiUVT 5'-UTR-Punktmutationen (pPC127–145) wurden mit dem Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs) unter Verwendung von pSW205-Pubi-lacZ (pPC125) als Vorlage konstruiert. Um Plasmide zu konstruieren, die für die markerlose Gendeletion (pPC146–147, 149–150) und Mutagenese (pPC148) verwendet werden, wurden Upstream- und Downstream-Regionen (ca. 1.000 bp), die das Zielgen oder die Zielregion flankieren, PCR-amplifiziert (wobei bei Bedarf Mutationen in der überlappenden Region enthalten waren). ) und durch Gibson-Assemblierung in pEXG2 (linearisiert mit SacI und KpnI) ligiert. Alle Plasmide wurden durch PCR, Restriktionsenzymverdau und, falls erforderlich, DNA-Sequenzierung verifiziert.

Verifizierte Plasmide wurden dann in E. coli SM10 λpir transformiert, gefolgt von der Konjugation in P. aeruginosa PA14, PAO1, B1 und deren Derivate. Die von pSW205 abgeleiteten Plasmide wurden direkt in P. aeruginosa elektroporiert. Zur Auswahl wurden geeignete Antibiotika verwendet, wie in der Ergänzungstabelle 3 angegeben. Um eine markerlose In-Frame-Deletion oder Mutagenese zu erzeugen, wurden Konjuganten mit an den Zielorten integrierter Deletionskassette auf Lysogenie-Brühe-Agarplatten mit niedrigem Salzgehalt, ergänzt mit 5 % Saccharose, gegenselektiert . Die erfolgreiche Löschung wurde durch PCR unter Verwendung flankierender Primer überprüft und bei Bedarf durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

Blastn-Suchen wurden auf pseudomonas.com und der Website des National Center for Biotechnology Information durchgeführt, um Orthologe von sicX und ubiUVT in der Gattung Pseudomonas und anderen Organismen zu identifizieren. Es wurden die sicX-Sequenz (für Abb. 1c und Extended Data Abb. 1), sicX mit seinen Nachbargenen (Abb. 1d) und ubiUVT mit seiner vorgelagerten intergenen Region (für Extended Data Abb. 4) aus dem Stamm P. aeruginosa PA14 verwendet als Abfragen. Aus vollständigen Bakteriengenomen identifizierte Orthologe mit E-Werten von <1 × 10–4, prozentualer Identität > 90 % und Abfrageabdeckungswerten von > 90 % wurden zur weiteren Analyse aufbewahrt. Sequenzen von sicX- und ubiUVT-Orthologen wurden mit MUSCLE43 abgeglichen. Um die Sequenzkonservierung von sicX- und ubiUVT-Orthologen zu analysieren, haben wir zunächst sicX- und ubiUVT-Orthologe mit MUSCLE abgeglichen. Als nächstes wurden die Alignment-Enden gekürzt und Lücken entfernt, und die Prozentsätze orthologer Sequenzen, die mit sicX- und ubiUVT-Abfragen identisch sind, wurden an jeder Nukleotidposition in R berechnet. Um erweiterte Daten in Abb. 4b, c zu erstellen, wurden die Alignments in Jalview44 mit visualisiert das Standardfarbschema für Nukleotide.

P. aeruginosa-Zellen wurden über Nacht in BHI-Brühe, ergänzt mit 50 mM KNO3, gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde in frischer BHI-Brühe (mit 50 mM KNO3) auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD600 nm) von etwa 0,05 verdünnt und dann bis zur logarithmischen Phase (OD600 nm etwa 0,5) gezüchtet. Log-Phase-Zellen wurden auf OD600 nm 0,2 verdünnt und zur 3-stündigen Kultivierung unter Schütteln (bei 100 U/min) bei 37 °C in die anaerobe Kammer überführt. Ein 100-μl-Volumen der anaeroben Kultur wurde zur Durchführung des β-Galactosidase-Assays verwendet (wie in Lit. 45 beschrieben). Als Vergleich dienten aerobe Log-Phase-Kulturen. Für die statische Kultivierung wurden logarithmische Phasenkulturen auf OD600 nm 0,05 verdünnt und in einer 96-Well-Platte (500 μl in jedem 1 ml tiefen Well) statisch bei 37 °C für 3 Stunden inkubiert. Die statischen Kulturen wurden dann für den β-Galactosidase-Assay verwendet.

Zur Erstellung der erweiterten Daten in Abb. 3a, b wurden Stämme, die UbiUVT-lacZ-Translationsfusionen enthielten, (3 μl OD600 nm 0,1-Kulturen) auf 0,2 μm große, mit Nuclepore-Spur geätzte Polycarbonatmembranen (Whatman) getupft, die darauf platziert wurden (raue Seite nach oben). BHI-Agarplatten mit 200 µg ml-1 X-gal, 50 mM KNO3 und 100 µg ml-1 Carbenicillin. Die Platten wurden dann vor der Bildgebung 20 Stunden lang in der anaeroben Kammer (lichtgeschützt) bei 37 °C inkubiert. Die β-Galactosidase-Aktivitäten wurden wie zuvor beschrieben geschätzt46. Kurz gesagt, Bilder von Koloniebiofilmen wurden in ImageJ in 8 Bit konvertiert. Zur Definition von Kolonieobjekten für Messungen wurde eine Schwellenwertbestimmung durchgeführt. Die mittlere Pixelintensität wurde für jede Kolonie gemessen und von der mittleren Pixelintensität einer Kolonie von WT PA14 subtrahiert.

P. aeruginosa-Zellen wurden zur vollständigen RNA-Extraktion aerob und anaerob gezüchtet. Zur Herstellung aerober Kulturen wurden Log-Phase-Zellen in BHI (mit 50 mM KNO3) auf OD600 nm 0,01 verdünnt und 3 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Um anaerobe Kulturen vorzubereiten, wurden Log-Phase-Zellen in BHI (mit 50 mM KNO3) auf OD600 nm 0,1 verdünnt und in der anaeroben Kammer 4 Stunden lang unter Schütteln bei 37 °C inkubiert. Für die vollständige RNA-Extraktion wurden P. aeruginosa-Kulturen zunächst über Nacht bei 4 °C in RNAlater gelagert. Als nächstes wurden die Zellen pelletiert und in RNase-freiem TE-Puffer, der 1 mg ml-1 Lysozym enthielt, resuspendiert. Die Proben wurden 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Zellen enzymatisch zu lysieren. Anschließend wurde ein Volumen von 1 ml RNA-Bee zugegeben und die Zellen wurden durch dreimaliges Schlagen der Perlen für 30 Sekunden weiter mechanisch lysiert. Den Proben wurde ein Volumen von 200 μl Chloroform zugesetzt und die wässrige und die organische Phase wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 13.000 g und 4 °C getrennt. Die wässrige Phase, die RNA enthielt, wurde mit 0,5 ml Isopropanol und 20 μg linearem Acrylamid vermischt. Nach einer Inkubation über Nacht bei –80 °C wurde die RNA pelletiert und mit 75 % Ethanol gewaschen. Luftgetrocknete Pellets wurden in 100 μl RNase-freiem Wasser resuspendiert. Die RNA-Konzentration für jede Probe wurde mit einem NanoDrop-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Ungefähr 1 μg Gesamt-RNA wurde auf einem 15 %igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Harnstoff-Gel aufgetrennt und auf Hybond-N+-Membranen (GE Healthcare) übertragen. Die Membranen wurden dann mit einem UV-Vernetzer (UVP) vernetzt und in Hybridisierungslösung (Takara) mit den angegebenen DNA-Oligonukleotiden (in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt) sondiert, die durch T4-Polynukleotidkinase mit [γ-32P]ATP (Perkin Elmer) radioaktiv markiert wurden (New England Biolabs). Die untersuchten Membranen wurden einem Phosphorschirm ausgesetzt und mit einem Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare) sichtbar gemacht. Bei Bedarf wurden die Membranen durch dreimaliges Inkubieren mit gekochtem 0,1 % SDS unter Rühren für 15 Minuten abgelöst. Die Größen der RNA wurden mit der RiboRuler Low Range RNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) sowie der Migration von Xylolcyanol (ca. 28 nt) und Bromphenolblau (ca. 8 nt) geschätzt.

Bakterienkulturen in BHI (mit 50 mM KNO3) wurden bis zur logarithmischen Phase (OD600nm etwa 0,5) gezüchtet und dann mit frischem Medium auf OD600nm 0,02 verdünnt. Als nächstes wurden 10 μl verdünnte Kulturen auf 0,2 μm Nuclepore Track-Etched Polycarbonat-Membranen (Whatman) getupft, die (mit der glatten Seite nach oben) auf BHI-Agarplatten (mit 50 mM KNO3) platziert wurden. Anschließend wurden die Platten 16 Stunden lang bei 37 °C in der anaeroben Kammer inkubiert. Membranen, die P. aeruginosa-Biofilme enthielten, wurden in die vorgefüllten BeadBug-Röhrchen übertragen, die 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthielten. Biofilme wurden durch 45-sekündiges Schlagen der Perlen mechanisch zerstört. Die KBE wurden durch Verteilen der verdünnten Zellsuspensionen auf PIA-Platten bestimmt.

P. aeruginosa PA14- und ΔsicX-Zellen wurden sowohl unter statischen als auch unter anaeroben Wachstumsbedingungen gesammelt, wie oben beschrieben (im Abschnitt mit dem Titel β-Galactosidase-Assay).

Für statische Wachstumsbedingungen wurden drei biologische Replikate für jeden Stamm gesammelt. Zellpellets wurden in Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin) (TCEP), pH 7,5) mit cOmplete Mini-Proteaseinhibitor-Cocktail resuspendiert (Roche). Nach drei Beschallungsrunden (3 × 10 s) auf Eis wurden die Überstände durch Sedimentation (21.130 g, 15 Min., 4 °C) geklärt. Aliquote (100 μg) jeder Probe wurden mit TCEP reduziert, mit Iodacetamid alkyliert und mit Tandem-Mass-Tags (TMTs) markiert. Die TMT-Kennzeichnung erfolgte gemäß dem vom Hersteller (Thermo Fisher) angegebenen Protokoll.

Experimente zur Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) wurden mit einem Nano-Ultraperformance-LC-System Dionex Ultimate 3000 Rapid Separation LC (RSLC) (Thermo Fisher Scientific) und einem Lumos Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die Trennung der Peptide erfolgte durch C18-Umkehrphasenchromatographie bei einer Flussrate von 300 nl/min unter Verwendung einer Thermo Scientific Umkehrphasen-Nano-EASY-Sprühsäule (Thermo Scientific PepMap C18; 2 mm Partikelgröße, 100 Å Pore). Größe, 75 mm Innendurchmesser und 50 cm Länge). Lösungsmittel A war Wasser/0,1 % Ameisensäure und Lösungsmittel B war 80 % (v/v) Acetonitril/20 % Wasser/0,1 % Ameisensäure. Der verwendete lineare Gradient betrug 2 % bis 40 % Lösungsmittel B über 93 Minuten (die gesamte LC-Laufzeit betrug 120 Minuten, einschließlich eines Waschschritts mit hohem organischen Anteil und einer Neuäquilibrierung der Säule).

Die eluierten Peptide wurden mittels einer EASY-Spray-Quelle (Thermo Fisher Scientific) in das Massenspektrometer gesprüht. Alle m/z-Werte, die eluierende Peptidionen darstellen, wurden in einem Orbitrap-Massenanalysator (auf eine Auflösung von 120.000 eingestellt) gemessen und bei m/z-Werten zwischen 380 und 1.500 Da gescannt. Datenabhängige MS/MS-Scans (Höchstgeschwindigkeit) wurden verwendet, um Vorläuferionen durch kollisionsinduzierte Dissoziation (normalisierter Kollisionsenergiewert, 35 %) automatisch zu isolieren und zu fragmentieren und in der linearen Ionenfalle zu analysieren. Einfach geladene Ionen und Ionen mit nicht zugewiesenen Ladungszuständen wurden von der Auswahl für MS/MS ausgeschlossen, und es wurde ein dynamisches Ausschlussfenster von 70 s verwendet. Die 10 am häufigsten vorkommenden Fragmentionen aus jedem MS/MS-Ereignis wurden dann für eine weitere Phase der Fragmentierung durch synchrone Vorläuferauswahl und MS/MS/MS47 in der Hochenergie-Kollisionszelle unter Verwendung einer Hochenergie-Kollisionsdissoziation (normalisierte Kollisionsenergie) ausgewählt Wert von 65 %). Die m/z-Werte und relativen Häufigkeiten jedes Reporterions und aller Fragmente (Massenbereich 100 bis 500 Da) in jedem MS3-Schritt wurden im Orbitrap-Analysegerät gemessen, das auf eine Auflösung von 60.000 eingestellt war. Dies wurde in Zyklen von 10 MS3-Ereignissen durchgeführt, wonach das Lumos-Instrument wieder zum Scannen der m/z-Verhältnisse der intakten Peptidionen überging und der Zyklus fortgesetzt wurde.

Proteome Discoverer v2.1 (Thermo Fisher Scientific) und Mascot (Matrix Science) v2.6 wurden zur Verarbeitung von Rohdatendateien verwendet. Die Daten wurden mit den Sequenzen von P. aeruginosa UCBPP-PA14 (mit gemeinsamem Repository für Adventivproteine ​​(cRAP) v1.0) abgeglichen. Für die Verarbeitung von Proteomikdaten wurde das R-Paket MSnbase v2.13 (Ref. 48) verwendet. Die unterschiedliche Proteinhäufigkeit wurde mit dem Limma-Paket v3.44.3 (Lit. 49) bewertet. Unterschiede in der Proteinhäufigkeit wurden mithilfe des Student-t-Tests statistisch bestimmt, wobei die Varianzen durch die Verwendung der empirischen Bayes-Methode von Limma moderiert wurden. Die P-Werte wurden für Mehrfachtests mit der Benjamini-Hochberg-Methode50 angepasst. Es wurde davon ausgegangen, dass die Häufigkeit von Proteinen nur dann zunahm oder abnahm, wenn ihr log2-Wert (fache Änderung) größer als 1 bzw. kleiner als –1 war und wenn ihr P-Wert <0,01 war.

Für anaerobe Wachstumsbedingungen wurden zwei biologische Replikate für PA14 und drei biologische Replikate für ΔsicX wie oben beschrieben gesammelt (im Abschnitt mit dem Titel β-Galactosidase-Assay). Kurz gesagt, die Proteine ​​in jeder Probe wurden gemäß dem Protokoll zur filtergestützten Probenvorbereitung51 reduziert, alkyliert und mit Trypsin verdaut. Die Peptide wurden mit TMTs markiert und durch Umkehrphasenchromatographie bei hohem pH-Wert wie zuvor beschrieben52 getrennt. Sie wurden wie zuvor beschrieben in 12 Fraktionen zusammengefasst53. Jede Fraktion wurde mittels Nano-LC-MS/MS analysiert und die Peptide wurden wie zuvor beschrieben54 mit den folgenden Modifikationen identifiziert. Die Umkehrphasenchromatographie wurde unter Verwendung einer hauseigenen gepackten Säule (40 cm lang × 75 μm Innendurchmesser × 360 μm Außendurchmesser, Dr. Maisch GmbH ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm Perlen) und einer 120-minütigen Säule durchgeführt Gradient. Die Rohdateien wurden mit dem Mascot-Algorithmus (v2.5.1) anhand einer Proteindatenbank durchsucht, die durch Kombination der Sequenzen von P. aeruginosa UCBPP-PA14 und einer Kontaminantendatenbank (cRAP, heruntergeladen am 21. November 2016 von http://www.thegpm) erstellt wurde. org) über Proteome Discoverer v2.1. Für unsere oben beschriebenen Analysen wurden nur Peptidspektralübereinstimmungen mit einem Erwartungswert von weniger als 0,01 („hohes Vertrauen“) verwendet.

Um Zellen für Lipidextraktionen vorzubereiten, verdünnten wir zunächst logarithmische Phasenkulturen (OD600 nm 0,5; aerob gezüchtet) in der anaeroben BHI-Brühe (ergänzt mit 50 mM KNO3) auf eine berechnete OD600 nm 0,05 und nach 6-stündiger anaerober Inkubation unter Schütteln Zellen wurden gesammelt, einmal mit PBS gewaschen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Zellzahlen wurden mit OD600nm geschätzt.

Gefrorene Proben wurden auf Eis aufgetaut. Ein 100-µl-Volumen eiskaltes Isopropanol mit 10 nM Coenzym Q10-d9 (deuteriertes UQ10 als interner Standard; Sigma-Aldrich) wurde zu 109 Zellen gegeben. Unter Zugabe von Glasperlen wurden die Proben kurz gevortext und mit TissueLyzer zweimal 5 Minuten lang homogenisiert, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation bei 21.100 g. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand zehnfach verdünnt und auf 4 °C überführt. Ultraperformance LC-MS wurde mit einem UltiMate 3000 durchgeführt, der mit einer Accucore C30-Säule (2,1 × 150 mm, 2,6 µm Partikelgröße; Thermo Fisher) ausgestattet und an ein Orbitrap ID-X-Massenspektrometriesystem gekoppelt war.

Die chromatographische Methode zur Probenanalyse umfasste die Elution mit Acetonitril/Wasser (60:40, Vol./Vol.) mit 10 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure (mobile Phase A) und Isopropanol/Acetonitril (90:10, Vol./Vol.) mit 10 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure (mobile Phase B) bei einer Flussrate von 0,4 ml min−1 unter Verwendung des folgenden Gradientenprogramms: 0 min 20 % B; 1 Minute 60 % B; 5 Min. 70 % B; 5,5 Min. 85 % B; 8 Min. 90 % B; 8,2 Min. 100 % B bis 10,5 Min. halten, dann 10,7 Min. 20 % B bis 12 Min. halten. Die Säulentemperatur wurde auf 50 °C eingestellt und das Injektionsvolumen betrug 5 µl.

Die Zielmoleküle UQ9 und deuteriertes UQ10 wurden durch hochenergetische Kollisionsdissoziation bei 20 Kollisionsenergien im positiven Modus fragmentiert. Die MS/MS-Übergänge für UQ9 und deuteriertes UQ10 betragen 812,66/197,08 und 889,77/206,18. Es wurden Standardkurven für UQ9 und deuteriertes UQ10 erstellt. Die Mengen an UQ9 und deuteriertem UQ10 in den Proben wurden anhand der Standardkurve berechnet.

Zur Erstellung von Wachstumskurven wurden Bakterienzellen in BHI (mit 50 mM KNO3) zunächst aerob bis zur logarithmischen Phase (OD600 nm etwa 0,5) gezüchtet und dann mit entweder aerober oder anaerober BHI-Brühe (mit 50 mM KNO3) auf OD600 nm 0,01 verdünnt. Das aerobe und anaerobe Wachstum von P. aeruginosa bei 37 °C (unter Schütteln) wurde durch Messung der OD600 nm überwacht.

Für Langzeitkompetitionsexperimente wurden PA14, ΔsicX, TetR (Resistenz durch Mini-CTX1) PA14 und TetR ΔsicX in BHI (mit 50 mM KNO3) bis zur logarithmischen Phase (OD600nm etwa 0,5) gezüchtet, bevor sie mit frischem Wasser auf OD600nm 0,4 verdünnt wurden Mittel. PA14 und TetR ΔsicX wurden im Verhältnis 1:1 gemischt und 100 μl der Zellmischungen wurden in 4 ml anaerobes BHI (mit 50 mM KNO3) überführt, gefolgt von einer Schüttelinkubation bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen. Nach 24 Stunden wurden 20 μl der Kultur in ein anderes Röhrchen mit 4 ml anaerobem BHI (mit 50 mM KNO3) überführt. Anschließend wurde die Kultur nacheinander täglich auf ähnliche Weise passagiert. Der Wettbewerb zwischen TetR PA14 und ΔsicX wurde ähnlich wie oben beschrieben durchgeführt. Die CFU-Werte von TetR- und TetS-Zellen wurden durch Ausplattieren von Kulturen (an jedem Tag) auf PIA sowie auf PIA mit 75 µg ml−1 Tet geschätzt.

RNA-Sekundärstrukturen wurden mithilfe von mfold26 mit Standardparametern vorhergesagt. IntaRNA 2.0 wurde verwendet, um Basenpaarungswechselwirkungen zwischen SicX-sRNA und ubiUVT-mRNA25 mit Standardeinstellungen vorherzusagen, und die Mindestanzahl an Basenpaaren in der Samenregion wurde auf 7 festgelegt.

Chronische Wundinfektionen bei Mäusen wurden mit weiblichen Swiss Webster-Mäusen (8–10 Wochen alt) im Wesentlichen wie zuvor beschrieben55 mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, es wurde eine dorsale Vollhautexzision durchgeführt, bei der eine kleine kreisförmige Wunde (mit einem Durchmesser von 1,5 cm) chirurgisch angelegt wurde. Nach der Exzision wurde die Wunde sofort mit einem semipermeablen Polyurethan-Verband abgedeckt. Zur Feststellung einer Infektion wurden insgesamt 104 KBE P. aeruginosa-Zellen auf das Wundbett unter dem Verband injiziert. Da Verbände erforderlich sind, um die kontraktile Heilung zu reduzieren und die Kontamination der Wunde mit anderen Bakterien zu minimieren, wurden sie während des gesamten Infektionsverlaufs genau überwacht und bei Bedarf ersetzt.

Zur Beurteilung der bakteriellen Belastung durch WT- und ΔsicX-Infektionen wurden Wundgewebe und Milz 10 Tage nach der Infektion oder zu einem frühen Zeitpunkt, wenn das Tier sterbend befunden wurde, entnommen (moribunde Mäuse, die nicht sofort identifiziert wurden, wurden von der CFU-Analyse ausgeschlossen). . Die Gewebe wurden in PBS 45 s lang in BeadBug-Röhrchen mit 2,8-mm-Stahlperlen (Sigma-Aldrich) unter Verwendung eines Mini-Beadbeater-16 (BioSpec Products) homogenisiert. Zur Zählung der KBE wurden homogenisierte Proben seriell verdünnt und auf PIA-Platten ausplattiert. Zur Untersuchung der Verbreitungsergebnisse einer WT-, ΔsicX-, ΔubiUVT- und ΔsicX-ubiC-Infektion (Abb. 3e) wurden 10 Tage nach der Infektion distale Organe, einschließlich Milz, Leber und Gallenblase, gesammelt, um das Vorhandensein oder Fehlen von P. aeruginosa-Zellen zu beurteilen . Um die makroskalige Organisation einer P. aeruginosa-Infektion zu untersuchen, wurde die Wunde 4 Tage nach der Infektion herausgeschnitten und eine Biopsiestanze mit 10 mm Durchmesser (Acu-Punch, Thermo Fisher Scientific) verwendet, um den Rand (ca. 0,98 cm2) abzutrennen. und Kernregionen (ca. 0,77 cm2). Zu Vergleichszwecken wurden die KBE dann anhand der Oberfläche normalisiert.

Die In-vivo-Biofilmausbreitung wurde mit weiblichen Swiss Webster-Mäusen (8–10 Wochen alt) im Wesentlichen wie zuvor beschrieben31 mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, die chirurgische Exzisionswunde der Maus wurde wie oben gezeigt verabreicht. Zur Feststellung einer Infektion wurden insgesamt 104 KBE P. aeruginosa-Zellen (PAO1) auf das Wundbett unter dem Verband injiziert. 48 Stunden nach der Infektion (nach der Bildung reifer Biofilme in Wunden) wurden die etablierten Wundinfektionen durch topische Anwendung von GHs oder cis-DA behandelt, um eine systemische Verbreitung zu induzieren. Konkret bestehen GHs aus bakterieller α-Amylase (aus Bacillus subtilis; MP Biomedicals) und Pilzcellulase (aus Aspergillus niger; MP Biomedicals). Eine 10 %ige (w/v) α-Amylase- und Cellulase-Lösung (in einer 1:1-Kombination) wurde durch Auflösen von pulverförmigen Enzymen in PBS hergestellt. cis-DA (Cayman Chemical Company) wurde in PBS auf eine Endkonzentration von 500 nM verdünnt. GH- und cis-DA-Lösungen wurden unmittelbar vor der Verwendung hergestellt. Die Wundbetten wurden mit einer GH- oder cis-DA-Lösung in drei separaten topischen Infusionen mit jeweils 30 Minuten Verweilzeit gespült. Topische Infusionen, die dispergierte Zellen enthielten (n = 2 Tiere für jede Behandlung), wurden abgesaugt und sofort in RNAlater (Thermo Fisher Scientific) gegeben. Bei einzelnen Tieren wurden mit P. aeruginosa infizierte Wundgewebe (n = 3 Tiere) zum Vergleich 48 Stunden nach der Infektion (ohne GH- oder cis-DA-Behandlung) sorgfältig aus dem umgebenden, nicht infizierten Gewebe und der darunter liegenden Muskelschicht herausgeschnitten. Infiziertes Wundgewebe wurde sofort in RNAlater (Thermo Fisher Scientific) gelegt.

Die Infektion mit Mäusepneumonie wurde mit weiblichen BALB/c-Mäusen (6–8 Wochen alt) im Wesentlichen wie zuvor beschrieben56 mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von 0,2 ml eines Cocktails aus Ketamin (25 mg ml–1) und Xylazin (12 mg ml–1) anästhesiert. Zur Infektion mit PA14-abgeleiteten Stämmen wurden Mäusen etwa 107 KBE (eine subletale Dosis) P. aeruginosa-Zellen (in 25 μl PBS) intranasal injiziert. Mäuse wurden 48 Stunden nach der Infektion eingeschläfert. Ganze Lungen und Milzen wurden aseptisch gesammelt, gewogen und in 1 ml PBS homogenisiert. Gewebehomogenate wurden seriell verdünnt und zur CFU-Zählung auf PIA ausplattiert. Für die Infektion mit PAO1-abgeleiteten Stämmen wurden 5 × 107 KBE (eine tödliche Dosis) von P. aeruginosa-Zellen als Inokula verwendet und 24 Stunden nach der Infektion wurden Gewebe gesammelt.

Eine subkutane Hautinfektion bei Mäusen (auch als Mausabszessmodell bekannt) wurde mit weiblichen Swiss-Webster-Mäusen (8 Wochen alt) im Wesentlichen wie zuvor beschrieben55 mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, der innere Oberschenkel der Maus wurde rasiert und alle verbleibenden Haare wurden mit einem Enthaarungsmittel (Nair) entfernt. Ein 100-μl-Volumen von etwa 1 × 107 KBE P. aeruginosa-Zellen (PA14 oder ΔsicX) wurde subkutan in die Oberschenkelinnenseite injiziert. Mäuse wurden 16 Stunden nach der Infektion eingeschläfert. Die Milzen wurden aseptisch gesammelt und in 1 ml PBS homogenisiert. Gewebehomogenate wurden seriell verdünnt und zur CFU-Zählung auf PIA ausplattiert.

RNA-Extraktionen wurden im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt14. Für die statische In-vitro-Kultivierung von PA14 wurden die Zellen zunächst wie oben beschrieben (im Abschnitt mit dem Titel „β-Galactosidase-Assay“) gezüchtet und sofort mit fünf Volumina RNA gemischt. Nach der Lagerung bei 4 °C über Nacht wurden die Zellen pelletiert, in nukleasefreiem TE-Puffer (Acros Organics) mit 1 mg ml-1 Lysozym resuspendiert und in Perlenschlagröhrchen mit einer Mischung aus großen und kleinen Perlen (2 mm) überführt Zirkonoxid bzw. 0,1 mm Zirkonoxid/Siliziumoxid). Für In-vivo-Experimente zur Biofilmausbreitung (wie oben beschrieben) wurden infizierte Gewebe aus RNAlater entfernt, mit TE-Puffer gemischt und in Perlenschlagröhrchen überführt. Sowohl In-vitro- als auch Gewebeproben in TE wurden durch Homogenisierung mit einem Mini-Beadbeater-16 kurzzeitig aufgeschlossen. Anschließend wurden die Proben 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Zellen enzymatisch zu lysieren. Als nächstes wurde 1 ml RNA-Bee zu 300 μl Probenhomogenat gegeben und die Proben wurden durch dreimaliges Schlagen der Perlen für 30 s weiter mechanisch lysiert. Ein Volumen von 200 μl Chloroform pro 1 ml RNA-Bee wurde hinzugefügt, und die Röhrchen wurden 30 Sekunden lang kräftig geschüttelt und dann 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Proben 30 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 g zentrifugiert, um die wässrige und organische Phase zu trennen. Die wässrige Phase wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt, dem 0,5 ml Isopropanol (pro 1 ml RNA-Bee) und 20 μg lineares Acrylamid zugesetzt wurden. Nach einer Inkubation über Nacht bei –80 °C wurden die Proben auf Eis aufgetaut und 30 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden zweimal mit 1 ml 75 %igem Ethanol gewaschen, 5 Minuten an der Luft getrocknet und in 100 μl RNase-freiem Wasser resuspendiert. Die RNA-Konzentration für jede Probe wurde mit einem NanoDrop-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die rRNA wurde mit einem MICROBExpress Kit (Thermo Fisher Scientific) für die In-vitro-Proben und einem QIAseq FastSelect Kit (QIAGEN) für von Mäusen stammende Proben abgereichert, gefolgt von einer Ethanolfällung. Die abgereicherte RNA wurde 2 Minuten lang mit dem NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module Kit fragmentiert und cDNA-Bibliotheken wurden mit dem NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit (New England Biolabs) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Bibliotheken wurden im Molecular Evolution Core am Georgia Institute of Technology auf einem Illumina NextSeq500 unter Verwendung von 75-bp-Single-End-Läufen sequenziert.

Zusätzlich zu den oben genannten RNA-seq-Bibliotheken, die in dieser Studie erstellt wurden, wurden 202 öffentlich zugängliche P. aeruginosa-RNA-seq-Datensätze analysiert, darunter 28 P. aeruginosa-Transkriptome aus menschlichen Proben, 28 aus Infektionsmodellen und 146 aus einer Reihe von genau definierte In-vitro-Bedingungen (aufgelistet in der Ergänzungstabelle 1). Die Qualität der Rohsequenzierungsablesungen wurde erstmals mit FastQC v0.11.7 (Ref. 57) bestätigt. Als nächstes wurden die RNA-seq-Reads an den 3'-Enden gekürzt, um den Illumina-Adapter (AGA TCG GAA GAG CAC ACG TCT GAA CTC CAG TCA C) unter Verwendung von Cutadapt 3.0 (Ref. 58) mit einem minimalen Leselängenschwellenwert von 22 Basen zu entfernen. Zugeschnittene Lesevorgänge wurden dann mithilfe von Bowtie2 v2.4.2 mit Standardparametern für die End-to-End-Ausrichtung auf das P. aeruginosa PA14-Referenzgenom (zum Download verfügbar von pseudomonas.com) abgebildet. Da PA1414 (sicX) ursprünglich als proteinkodierendes Gen annotiert wurde, haben wir zunächst Lesevorgänge proteinkodierenden Genen mit featureCounts Subread v2.0.1 zugewiesen (Ref. 60; Ergebnisse in Abb. 1a dargestellt). Für die verbleibenden Analysen (Abb. 1b, 2a und 4b–d und Extended Data Abb. 2b und 10) wurden Lesevorgänge gezählt, die sowohl proteinkodierenden Genen als auch 199 sRNAs15 zugeordnet waren.

Die differentielle Expression wurde mit DESeq2 bestimmt (Abb. 1a und 4b – d; Lit. 61). Um die sicX-Ausdrucksniveaus in verschiedenen Proben zu vergleichen (Abb. 1a und Extended Data Abb. 5), wurden Rohlesevorgänge mithilfe der Funktion varianceStabilizingTransformation() im DESeq2-Paket normalisiert. Um die relative Transkripthäufigkeit verschiedener Merkmale (proteinkodierende Gene, sRNAs, sicX und/oder rsmYZ) abzuschätzen, haben wir TPM berechnet. Zunächst wurden die Rohzahlen anhand der Merkmalslänge (Genlänge) normalisiert, um Lesevorgänge pro Kilobase (RPK) zu generieren. Als nächstes wurden alle RPK-Werte hochgezählt und durch 1.000.000 dividiert, um den Skalierungsfaktor zu bestimmen. Schließlich wurde die RPK jedes Gens durch den Skalierungsfaktor dividiert. Die resultierenden TPM-Werte wurden zur Erstellung der Abbildungen verwendet. 1b und 2a und erweiterte Datenabbildungen. 2b und 10. Um das Ausrichtungsmuster von sicX-Lesevorgängen zu untersuchen, wurde samtools v1.13 verwendet, um die Lesetiefe zu messen, die den sicX-Locus an jeder Nukleotidposition umfasst62. Die Lesetiefe wurde dann vor dem Plotten mithilfe der Funktion „estimateSizeFactors()“ in DESeq2 normalisiert.

Ein phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit wurde in PhyML 3.0 (Lit. 63) unter Verwendung von 365 16S-rRNA-Sequenzen erstellt, die verschiedene Pseudomonas-Isolate repräsentieren. Zur besseren Visualisierung des Baums haben wir nur etwa 50 16S-Sequenzen aus den P. aeruginosa-Stämmen einbezogen. Die 16S-Sequenzen wurden mit MUSCLE abgeglichen und als Eingabe in PhyML 3.0 verwendet. Die am besten passenden Evolutionsmodelle wurden mit dem korrigierten Akaike-Informationskriterium vorhergesagt. Der Baum wurde in iTOL64 visualisiert und mit Anmerkungen versehen.

Die Analyse der Genontologie-Anreicherung wurde mit Galaxy v2.0.1 durchgeführt. Differenziell exprimierte Gene als Reaktion auf GH- oder cis-DA-Behandlung wurden mithilfe der Gene Ontology-Datei (erhalten von http://geneontology.org/docs/download-ontology) und der P. aeruginosa PAO1 Gene Ontology-Begriffsanmerkungen (erhalten von https) analysiert ://pseudomonas.com/goterms/list). Es wurde ein Benjamini-Hochberg-Test mit einem P-Wert-Grenzwert < 0,05 durchgeführt.

Alle Experimente wurden unabhängig voneinander mindestens dreimal (sofern in den Legenden der Abbildungen nicht anders angegeben) mit ähnlichen Beobachtungen durchgeführt. Die genauen n-Werte für Tierversuche sowie In-vitro-Versuche sind in den Abbildungen und Legenden angegeben. Statistische Analysen wurden mit Prism GraphPad 9 durchgeführt und sind in den Legenden der Abbildungen angegeben. Für das Northern Blot wurde jedes Experiment mindestens zweimal unabhängig voneinander (unter Verwendung frisch extrahierter RNA-Proben) mit ähnlichen Beobachtungen durchgeführt und repräsentative Bilder werden gezeigt.

Alle Eingriffe an Mäusen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tiere wurden artgerecht behandelt und in temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Einrichtungen (18–22 °C; 40–50 %) mit 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen gehalten. Das Protokoll für die chronische Wundinfektion bei Mäusen wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Texas Tech University Health Sciences Center (Protokollnummer 07044) und vom IACUC des Georgia Institute of Technology (Protokollnummer A100127) genehmigt. Das Protokoll für das subkutane Infektionsmodell der Maus wurde vom IACUC des Georgia Institute of Technology genehmigt (Protokollnummer A100127). Für das Maus-Pneumonie-Infektionsmodell wurden alle experimentellen Verfahren gemäß den Richtlinien des IACUC der Emory University unter der genehmigten Protokollnummer DAR-201700441 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Proteomik-Datensätze wurden im ProteomeXchange-Konsortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset) mit den Zugangsnummern PXD032985 und PXD032986 hinterlegt. Rohdaten unserer RNA-seq-Studien wurden im Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) unter den BioProject-Nummern PRJNA934328 und PRJNA904394 hinterlegt. Die 202 öffentlich zugänglichen Transkriptome von P. aeruginosa, die in dieser Studie analysiert wurden, sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst und können im Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) mit der entsprechenden Zugangsnummer bezogen werden . Das P. aeruginosa PA14-Referenzgenom (BioSample-Zugang SAMN02603591) steht zum Download unter https://pseudomonas.com zur Verfügung. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v4: aktuelle Updates und neue Entwicklungen. Nukleinsäuren Res. 47, W256–W259 (2019).

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Wir danken D. Cornforth und anderen Mitgliedern des Labors von MW für die hilfreiche Diskussion des Manuskripts und die Unterstützung bei den Tierversuchen. Wir danken G. Welch und H. Hui für die Hilfe bei den Tierversuchen. Wir danken S. Brown, S. Diggle und C. Baskett für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die proteomischen und metabolomischen Studien wurden von der Georgia Institute of Technology Systems Mass Spectrometry Core Facility sowie dem Cambridge Centre for Proteomics unterstützt. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health mit den Zuschüssen R21AI154220 (an MW), R21AI137462 (an KPR) und R21AI147178 (an CSS), den Zuschüssen der Cystic Fibrosis Foundation WHITEL20A0 und WHITEL22G0 (an MW) und der Cystic Fibrosis Trust Foundation SRC017 (an MW) unterstützt. PC und SKD werden durch die Cystic Fibrosis Postdoctoral Fellowships CAO20F0 bzw. DOLAN20F0 unterstützt.

Derek Fleming

Aktuelle Adresse: Abteilung für klinische Mikrobiologie, Abteilung für Labormedizin und Pathologie, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

Whitni K. Redman

Aktuelle Adresse: Department of Biological Sciences, Binghamton University, Binghamton, NY, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Stephen K. Dolan, Kayla H. Szymanik

School of Biological Sciences, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Pengbo Cao, Stephen K. Dolan, Anayancy Ramos, Frances L. Diggle und Marvin Whiteley

Emory-Children's Cystic Fibrosis Center, Atlanta, GA, USA

Pengbo Cao, Dina A. Moustafa, Stephen K. Dolan, Anayancy Ramos, Frances L. Diggle, Joanna B. Goldberg und Marvin Whiteley

Zentrum für mikrobielle Dynamik und Infektion, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Pengbo Cao, Stephen K. Dolan, Anayancy Ramos, Frances L. Diggle und Marvin Whiteley

Abteilung für Chirurgie, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX, USA

Derek Fleming, Whitney K. Redman und Kendra P. Rumbaugh

Abteilung für Immunologie und Molekulare Mikrobiologie, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX, USA

Derek Fleming, Whitney K. Redman und Kendra P. Rumbaugh

Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX, USA

Derek Fleming, Whitney K. Redman und Kendra P. Rumbaugh

Abteilung für Pädiatrie, Abteilung für Lungenheilkunde, Asthma, Mukoviszidose und Schlaf, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, USA

Dina A. Moustafa und Joanna B. Goldberg

Abteilung für Molekulare Biowissenschaften, University of Texas at Austin, Austin, TX, USA

Kayla H. Szymanik und Christopher S. Sullivan

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PC und MW konzipierten und gestalteten die Studie, analysierten Daten und verfassten das Manuskript; DF, DAM, PC, WKR und FLD trugen zu verschiedenen Aspekten von Tierversuchen bei; SKD bereitete Proben vor und führte Datenanalysen für die Proteomik durch; KHS führte Northern Blots und Analysen durch; PC, MW und AR konstruierten Bakterienstämme und führten Reportertests durch; PC führte alle anderen Experimente und Datenanalysen durch; CSS, JBG und KPR stellten technische Beratung zur Verfügung und analysierten Daten.

Korrespondenz mit Marvin Whiteley.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Der Maximum-Likelihood-Baum besteht aus 16s-rDNA-Sequenzen repräsentativer Stämme der Gattung Pseudomonas. Cluster mit häufig vorkommenden Arten werden durch farbige Kästchen gekennzeichnet. Stämme, von denen berichtet wurde, dass sie aus der Umgebung von Menschen oder Krankenhäusern isoliert wurden, werden hervorgehoben.

A. Schematische Darstellung der Mutagenese des Anr-Bindungsmotivs. B. Abbildung 2a mit der Hinzufügung von fünf In-vitro-Transkriptomen mit statischem Wachstum (blaue Kreise; die RNA-seq-Bibliotheken wurden nach der gleichen Methode erstellt, die in unserer Studie zu P. aeruginosa-Transkriptomen beim Menschen verwendet wurde). C. Planktonisches Wachstum (OD600) von WT und ΔPA1414 in Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff. Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten. D. RNA-seq-Reads, die während des aeroben und anaeroben In-vitro-Wachstums auf den PA1414-Locus (sicX) ausgerichtet sind. e. Koloniebiofilmwachstum von ΔsicX, das verschiedene sicX-Mutationen beherbergt (wie in Abb. 2g dargestellt), unter aeroben Bedingungen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. n = 4 unabhängige Experimente. Es wurde ein zweiseitiger Mann-Whitney-Test zum Vergleich von WT und jedem anderen Stamm durchgeführt (ns, nicht signifikant). F. Northern-Blot-Analysen verschiedener sicX-Allele, wie in Abb. 2g dargestellt. Die sRNA-Häufigkeit wurde geschätzt, indem zunächst die 5S-rRNA (Beladungskontrolle) normalisiert und anschließend mit dem WT-Wert verglichen wurde. Die anaerobe Wachstumsfitness wurde mit + (kein Defekt) und – (Defekt) angegeben. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

A. Vorhergesagte Basenpaarung zwischen SicX- und ubiUVT-mRNA. Fett hervorgehobene Nukleotide unterlagen Punktmutationen (A → U, U → A, G → C, C → G), die über den Translationsreporter ubiUVT-lacZ bewertet wurden. Unter anaeroben Bedingungen gezüchtete Kolonien-Biofilme wurden wie beschrieben auf β-Galactosidase-Aktivitäten untersucht46. Heatmap zeigt die Mittelwerte an. Nukleotide, die kompensatorischen Basenveränderungen unterliegen, werden mit magentafarbenen Rändern hervorgehoben. Vorhergesagte Basenpaarungsregionen werden mit gestrichelten Rändern hervorgehoben. B. Die β-Galactosidase-Aktivitäten (Einzelwerte) des in (A) gezeigten Experiments wurden wie beschrieben quantifiziert46. Mögliche kompensatorische Mutationen sind blau hervorgehoben. Grüne gestrichelte Linien zeigen die mittleren β-Galactosidase-Aktivitäten in WT und ΔsicX. AU, beliebige Einheit. n = 5 unabhängige Experimente. C. β-Galactosidase-Assays zur Bewertung, ob 5'-UTR-Mutationen die ubiUVT-Translation unabhängig von SicX während des statischen Wachstums verändern können. WT und ΔsicX, die den ubiUVT-lacZ-Reporter beherbergen (gezüchtet als anaerobe Koloniebiofilme), wurden ebenfalls mit diesem Assay bewertet. n ≥ 3 unabhängige Experimente. D. β-Galactosidase-Assays zeigen, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit von Hfq keinen Einfluss auf die Induktion der ubiUVT-Translation durch SicX hat. n ≥ 5 unabhängige Experimente. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. Für b–c wurde ein zweiseitiger Mann-Whitney-Test durchgeführt (ns, nicht signifikant).

A. Die prozentuale Identität von 258 ubiUVT-Orthologen (im Vergleich zum ubiUVT-Allel von PA14) auf der Einzelnukleotidskala. Die sicX-Bindungsstelle an der 5'-UTR ist hervorgehoben. B. DNA-Sequenz-Alignment der vorgelagerten intergenen Region von 258 ubiUVT-Orthologen. C. DNA-Sequenz-Alignment von 258 sicX-Orthologen (nur die sRNA-Region wird angezeigt). Die Seed-Region in SicX und die Zielregion in der 5'-UTR von ubiUVT sind angegeben.

A. RNA-seq-Reads, die auf den PA1414-Locus (sicX) bei chronischen Wundinfektionen bei Mäusen ausgerichtet sind. B. Der sicX-RNA-Spiegel in der chronischen Wunde der Maus ist mit dem beim Menschen vergleichbar. Linien geben Mittel an. Zum Vergleich der Bakterienbelastung wurde der zweiseitige Mann-Whitney-Test verwendet (ns, nicht signifikant). C. Bakterielle Belastungen in der Wunde (Informationen zur Verbreitung in Abb. 3e). Linien geben Mittel an. n = 9 Tiere (für jede Gruppe) über drei unabhängige Experimente. Der zweiseitige Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um die Bakterienbelastung von WT und jeder anderen Mutante zu vergleichen (ns, nicht signifikant).

Quelldaten

P. aeruginosa-Zellen (~107 KBE) wurden subkutan in den inneren Oberschenkel der Maus injiziert, um eine systemische Infektion auszulösen. Die bakterielle Belastung der Milz wurde 16 Stunden nach der Infektion beurteilt. WT (n = 7) und ΔsicX (n = 8). Linien geben Mittel an. Es wurde ein zweiseitiger Mann-Whitney-Test verwendet.

Quelldaten

A. Schematische Darstellung der Mutagenese in der 5'-UTR von ubiUVT: SicX-Bindungsstelle, Ribosomen-Bindungsstelle und Startcodon sind unterschiedlich gefärbt; die Stamm-Schleifen-Struktur ist hervorgehoben; Mutagenese (ubiC) ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. B. Wiederherstellung der UbiUVT-Übersetzung in ΔsicX. Der β-Galactosidase-Assay wurde durchgeführt, um die Translationsaktivität von ubiUVT mit und ohne 5'-UTR-Mutation zu bewerten, wie in A (n = 6) beschrieben. CD. Wachstumsausbeute von Kolonie-Biofilmen in Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff (n = 4). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. Signifikante Unterschiede (im Vergleich zum WT) sind mit Sternchen (*, P < 0,05; **, P < 0,01; Zweiseitiger Mann-Whitney-Test) gekennzeichnet.

A. Schematische Darstellung des Mäuse-Lungenentzündungsinfektionsexperiments. B. P. aeruginosa-Belastung in der Lunge. Linien geben Mittel an. C. P. aeruginosa-Belastung in der Milz. Linien geben Mittel an. Zum Vergleich der Bakterienbelastung wurde der zweiseitige Mann-Whitney-Test verwendet. Zusammenfassung zweier biologischer Replikate für b und c.

Quelldaten

Die Begriffe der Genontologie (GO) sind links gekennzeichnet. Der genaue Test von One-tailed Fisher wurde durchgeführt. Unten, herunterreguliert; hoch, hochreguliert.

A. Schematische Darstellung der Gac-Rsm-Kaskade in P. aeruginosa. Komponenten, die den Lebensstil von Biofilm (grün) und Plankton (blau) fördern, sind farblich gekennzeichnet. B. Relative Transkripthäufigkeit (TPM, Transkripte pro Million) von sicX im Vergleich zu allen proteinkodierenden Sequenzen (CDS), rsmYZ-sRNAs und den übrigen nicht-kodierenden sRNAs in 202 untersuchten Transkriptomen in Abb. 2a. Transkriptome werden vom höchsten zum niedrigsten sicX-TPM sortiert. C. Eine Heatmap, die das mittlere TPM von CDS, sRNAs, rsmYZ und sicX in P. aeruginosa-Transkriptomen zeigt. D. β-Galactosidase-Assays belegen, dass die Expression von sicX unabhängig von GacS-GacA ist. PsicX-lacZ, lacZ transkriptionell an den sicX-Promotor fusioniert. MrT7, MAR2xT7-Transposon. n = 4 in allen Experimenten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. Der signifikante Unterschied (im Vergleich zum WT) wurde mit einem zweiseitigen Mann-Whitney-Test analysiert (ns, nicht signifikant).

Diese Datei enthält ergänzende Abbildung 1, Tabellen 1–3 und Referenzen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Cao, P., Fleming, D., Moustafa, DA et al. Eine kleine RNA von Pseudomonas aeruginosa reguliert chronische und akute Infektionen. Natur 618, 358–364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06111-7

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Eingegangen: 26. Oktober 2022

Angenommen: 21. April 2023

Veröffentlicht: 24. Mai 2023

Ausgabedatum: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06111-7

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