Die Kombination von Hydroxychloroquin und 2

Jul 19, 2023

Cell Death Discovery Band 8, Artikelnummer: 286 (2022) Diesen Artikel zitieren

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2-Desoxyglucose (2-DG) kann in der Antitumorforschung eingesetzt werden, indem es die Glykolyse hemmt und den endoplasmatischen Retikulumstress (ERS)-Weg fördert, seine klinische Anwendung ist jedoch aufgrund dosislimitierender Nebenwirkungen und der Überlebenschancen von Krebszellen durch schützende Autophagie eingeschränkt . Daher untersuchten wir in unserer Forschung, ob die Kombination von Hydroxychloroquin (HCQ), einem von der FDA zugelassenen Medikament zur Hemmung der Autophagie, und 2-DG eine vielversprechende Therapiestrategie ist. Hier berichten wir, dass HCQ in Kombination mit 2-DG im Vergleich zu anderen Einzelmedikamenten die Lebensfähigkeit und Migration von Brusttumorzellen weiter hemmen und die Apoptose induzieren kann. Die Kombination von 2-DG und HCQ kann die Größe des transplantierten Tumors und die Metastasierung von Tumorzellen in Lunge und Leber in vivo erheblich reduzieren. Auf zellulärer Ebene unterdrückte HCQ die Bildung von Autolysosomen und beendete den durch 2-DG-vermittelte ERS induzierten Autophagieprozess, was zur kontinuierlichen Akkumulation fehlgefalteter Proteine ​​im endoplasmatischen Retikulum führte, was durch PERK-eIF2α-ATF-4- zu anhaltender ERS führte. CHOP-Achse und löste die Transformation von einem Überlebensprozess zum Zelltod aus. Unsere Forschung verstärkte das Forschungsinteresse an metabolischen Disruptoren bei dreifach negativem Brustkrebs und betonte das Potenzial der Kombination von 2-DG und HCQ als Antikrebsbehandlung.

Brustkrebs ist einer der am häufigsten diagnostizierten Tumoren bei Frauen [1]. Trotz der klinischen Anwendung neuer Techniken wie Früherkennung, Bildgebung und gezielter Therapie sterben jedes Jahr viele Frauen an der Progression des Brustkrebses [2]. Hundebrusttumoren (CMTs) gehören ebenfalls zu den Tumorarten mit der höchsten Inzidenz bei unkastrierten Hunden [3]. CMTs sind eines der besten Tiermodelle zur Untersuchung menschlicher Tumoren, da sie ähnliche physiologische, genetische und epidemiologische Eigenschaften aufweisen [4]. Allerdings sind die derzeit verwendeten Chemotherapeutika aufgrund ihrer starken zytotoxischen Nebenwirkungen und Arzneimittelresistenzen begrenzt [5, 6]. Daher sind sichere und wirksame neue Therapiestrategien dringend erforderlich.

Krebszellen gewinnen durch Glykolyse eher Energie aus Glukose als normale Zellen, die ATP durch oxidative Phosphorylierung produzieren [7]. Daher gilt die Unterdrückung der Glykolyse als wirksame potenzielle Therapiestrategie für Brusttumoren [8].

2-Desoxyglucose (2-DG) ist ein Glukoseanalogon und kann an Glukosetransporter binden, die Schlüsselproteine ​​für die Glukoseabsorption sind, um die Glukoseabsorption kompetitiv zu hemmen und die Glykolyse weiter zu hemmen [9, 10]. Darüber hinaus ist 2-DG-GDP ein nachgeschaltetes Produkt des 2-DG-Metabolismus, das aufgrund seiner Strukturähnlichkeit zu Mannose-GDP die N-verknüpfte Glykosylierung beeinträchtigen kann [11]. Daher kann 2-DG auch die kontinuierliche Ansammlung von ungefalteten/fehlgefalteten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum (ER) induzieren, was zu endoplasmatischem Retikulumstress (ERS) und anschließendem Tod führen kann [12, 13]. Andererseits aktiviert ERS die schützende Autophagie und vermittelt die Eliminierung defekter Proteine ​​und Organellen, was möglicherweise der Grund dafür ist, dass die 2-DG-Monotherapie nur wenige positive Ergebnisse erbracht hat [14, 15].

Hydroxychloroquin (HCQ) wird häufig zur Behandlung klinischer Erkrankungen eingesetzt, darunter Rheumatologie und Infektionskrankheiten [16, 17]. Darüber hinaus zeigen aktuelle Forschungsergebnisse die positive Rolle von HCQ in der Onkologieforschung, da es die Autophagie durch Entsäuerung von Lysosomen hemmen kann [18, 19].

In dieser Studie zeigen wir, dass die kombinierte Behandlung von HCQ und 2-DG einen synergistischen Effekt auf die Hemmung der Lebensfähigkeit von 4T1-Zellen (Maus-Ursprung) und CMT-7364-Zellen (Hund-Ursprung) unter dem Mechanismus der Autophagie-Hemmung und anhaltenden ERS hat.

Wie bereits berichtet, sind HCQ und 2-DG für eine Vielzahl von Krebszellen zytotoxisch [12, 19]. Um die Wirkungsweise von Arzneimitteln bei verschiedenen Arten von Brusttumoren umfassender zu untersuchen, haben wir uns für CMT-7364- und 4T1-Zellen entschieden, bei denen es sich üblicherweise um Modelle menschlicher Brusttumoren handelt. Zellen, die mit steigenden Konzentrationen von HCQ oder 2-DG behandelt wurden, zeigten eine dosisabhängige Abnahme der Lebensfähigkeit (Abb. 1A, B). Die IC50-Werte der mit HCQ behandelten CMT-7364- und 4T1-Zellen lagen beide bei >50 μM. Basierend auf diesen Ergebnissen und früheren Berichten haben wir 10 μM HCQ für weitere Studien ausgewählt. Im Gegensatz zu 2-DG allein erhöhten 10 μM HCQ in Kombination mit unterschiedlichen Konzentrationen von 2-DG die Zytotoxizität (Abb. 1B). Der IC50 von 2-DG in CMT-7364- und 4T1-Zellen war mit 0,9853 bzw. 0,7360 mM ungefähr gleich. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde 1 mM 2-DG für weitere Experimente verwendet.

A, B Die 24-Stunden-IC50-Werte von HCQ und 2-DG wurden in 4T1- und CMT-7364-Zellen berechnet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Cell Counting Kit-8 bestimmt. Die Kombination von 2-DG und HCQ hatte eine stärkere zytotoxische Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen als 2-DG allein. n = 5 für jede Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. **p < 0,01, ****p < 0,0001, ns = nicht signifikant (p ≥ 0,05).

Es wurde gezeigt, dass 2-DG die Zellproliferation hemmt und die Zellapoptose bei Brustneoplasien induziert, muss jedoch normalerweise mit anderen Medikamenten kombiniert werden, um bessere Ergebnisse zu erzielen [19, 20]. Im Vergleich zur NC-Gruppe erhöhte die Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von 2-DG die Expression apoptotischer Proteine ​​in CMT-7364-Zellen signifikant (Abbildung S1). Allerdings gab es keinen Unterschied in diesen Proteinexpressionsniveaus zwischen den verschiedenen Konzentrationsgruppen (Abbildung S1), was auf die dosislimitierenden Nebenwirkungen von 2-DG in CMT-7364-Zellen schließen lässt. Daher haben wir untersucht, ob die Zugabe von HCQ die wirksame Arzneimitteldosis von 2-DG in CMT-7364- und 4T1-Zellen verringern kann. Im Vergleich zur NC-Gruppe war die Lebensfähigkeit von CMT-7364- und 4T1-Zellen 48 und 72 Stunden nach der Behandlung mit HCQ und 2-DG deutlich gehemmt, und ihre Kombinationsbehandlung führte zu einer geringeren Zelllebensfähigkeit und Zelldichte als 2-DG allein ( Abb. 2A). Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass es zu einem massiven Zelltod gekommen ist.

Ein Cell Counting Kit-8 Kits wurden verwendet, um die Proliferation von 4T1- und CMT-7364-Zellen zu bewerten, die mit HCQ, 2-DG oder HCQ in Kombination mit 2-DG nach 0, 12, 24, 48 und 72 Stunden behandelt wurden. n = 3 unabhängige Experimente, die für jede Bedingung fünffach durchgeführt wurden. B, C Wundheilungstests von 4T1- und CMT-7364-Zellen nach 24-stündiger HCQ- und 2-DG-Behandlung allein oder in Kombination. Es werden repräsentative Bilder gezeigt, die den Beginn (t = 0 h) und das Ende (t = 24 h) des Aufnahmezeitraums darstellen. n = 3 unabhängige Experimente, die für jede Bedingung dreifach durchgeführt wurden. D, E Zellapoptosetests von 4T1- und CMT-7364-Zellen, behandelt mit HCQ, 2-DG oder einer Kombination davon, unter Verwendung von FACS. Die Zellen wurden gesammelt und mit Annexin V-FITC und PI markiert. n = 3 unabhängige Experimente, die für jede Bedingung dreifach durchgeführt wurden. F, G Western-Blot-Analysen von Bax, Bcl-2, gespaltener Caspase-3 (C-Casp3) und gespaltenem PARP (C-PARP) in Zellen, die 24 Stunden lang mit HCQ und 2-DG allein oder in Kombination behandelt wurden. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. H Immunfluoreszenzfärbung von C-Casp3 in 4T1- und CMT-7364-Zellen, die 24 Stunden lang mit HCQ und 2-DG allein oder in Kombination behandelt wurden. Maßstabsbalken: 200 μm. n = 3 unabhängige Experimente, die für jede Bedingung dreifach durchgeführt wurden. Alle Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns = nicht signifikant (p ≥ 0,05).

Mithilfe eines Wundheilungstests wurde der Zusammenhang zwischen der Abnahme der Zelllebensfähigkeit und der Hemmung der Zellmigration untersucht. Wir haben die Wirkung von HCQ allein nicht beobachtet, wohingegen 2-DG und ihre Kombination die Zellmigration in CMT-7364-Zellen signifikant hemmten. Im Gegensatz dazu reduzierten HCQ und 2-DG allein die Zellmigration im Vergleich zur Kontrolle in ähnlicher Weise, und ihre Kombination hemmte die Zellmigration in 4T1-Zellen signifikant (Abb. 2B, C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination von HCQ und 2-DG die Zellmigrationseffekte stark unterdrückte.

Apoptose ist ein wesentlicher regulatorischer Prozess, der die zelluläre Homöostase von Krebszellen aufrechterhält. Daher wurden die Apoptoseraten durch Annexin V/PI-Färbung gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Apoptose der HCQ- und 2-DG-Gleichbehandlungsgruppe signifikant höher war als die der Negativkontrolle und der einzelnen Behandlungsgruppen (Abb. 2D, E). Darüber hinaus haben wir auch die Proteinspiegel von Bax, Bcl-2, C-Caspase-3 und C-PARP bewertet, die typische apoptotische Proteine ​​in Krebszellen sind (Abb. 2F, G). Die Expressionsniveaus von C-Caspase-3-Proteinen wurden durch immunhistochemische Analyse nachgewiesen (Abb. 2H). Diese Ergebnisse stimmen mit den oben genannten Schlussfolgerungen überein. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass die Kombination von 2-DG und HCQ in vitro zu wirksamen Antitumoreigenschaften beiträgt.

Um die Ergebnisse der In-vitro-Experimente weiter zu validieren, wurde ein subkutanes Homotransplantations-Mausmodell etabliert. Wie die Ergebnisse zeigen (Abb. 3A–C), waren die Tumorvolumina und -gewichte der kombinierten Behandlung mit HCQ und 2-DG nach 4-wöchiger Behandlung signifikant niedriger als die der Negativkontrolle. Die Ergebnisse von 2-DG und 1/2 2-DG in Kombination mit einer HCQ-Behandlung zeigten ähnliche Kurven. Bei den behandelten Mäusen wurde im Vergleich zu den Kontrollen kein signifikanter Unterschied im Körpergewicht festgestellt (Abb. 3D). Wir untersuchten die histopathologischen Merkmale von Tumoren und lebenswichtigen Organen weiter durch H&E-Färbung (Abb. 3E). Es wurden keine offensichtlichen histopathologischen Anomalien in Milz, Herz oder Niere beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Medikamente bei Mäusen nur geringe bis keine toxischen Wirkungen und Nebenwirkungen hatten. Tumorschnitte der Kombinationsgruppe zeigten einen höheren Anteil an Zellen mit fragmentierten Kernen als die der 2-DG-Gruppe, HCQ-Gruppe und NC-Gruppe, was schwerwiegendere pathologische Veränderungen des Tumors in situ zeigt, der mit 2-DG und HCQ behandelt wurde. Darüber hinaus war der Grad der Kernfragmentierung in Tumorzellen in der 100-mg/kg-2-DG-Gruppe und in der 50-mg/kg-2-DG-Gruppe in Kombination mit der HCQ-Gruppe ähnlich, was auf eine Dosisreduktion von 2-DG durch die Zugabe von HCQ hindeutet. Diese Änderungen des Tumorabschnitts stimmten mit den Änderungen des Tumorvolumens und -gewichts in Abb. 3A – C überein.

Weibliche BALB/c-Mäuse wurden in fünf Gruppen eingeteilt, und die Injektion der angegebenen Medikamente begann am fünfzehnten. A–C Alle 2 Tage wurden das Tumorvolumen und das Körpergewicht gemessen (n = 5 pro Gruppe). D Am 40. Tag wurden die Mäuse auf humane Weise getötet, Proben entnommen und das Tumorgewicht gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Die Symbole ns, *, **, **** bezeichnen signifikante Unterschiede von nicht signifikant (p ≥ 0,05), P < 0,05, P < 0,01 bzw. P < 0,0001 gegenüber der Negativkontrollgruppe. E Repräsentative Panels der H&E-Färbung von Tumoren und wichtigen lebenswichtigen Organen wie Leber, Lunge, Milz, Herz und Nieren von Mäusen. Maßstabsbalken: 50 μm. Blau umrandete Kästchen an den Abschnitten der Leber weisen auf metastatische 4T1-Zellen hin.

Darüber hinaus wurde eine signifikante Tumormetastasierung in Leber und Lunge der Kontrollgruppe mit PBS-Injektion beobachtet (die Metastasierung wurde durch die blauen Linienkästen im Leberabschnitt und durch die zwischen den Alveolen gefüllten Zellen im Lungenabschnitt angezeigt). Verglichen mit der Tumormetastasierung in der Einzelmedikamentengruppe und der NC-Gruppe waren die Metastasierungsherde in Leber und Lunge in der 2-DG- und HCQ-Gruppe signifikant reduziert, was darauf hindeutet, dass die Kombination von Medikamenten die Tumormetastasierung reduzieren könnte. Dieses Ergebnis muss jedoch durch weitere experimentelle Daten gestützt werden, die möglicherweise im Mittelpunkt der Folgeforschung zur Kombination von 2-DG und HCQ stehen.

Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzfärbung der Tumorschnitte, dass die Akkumulation von LC3 und gespaltener Caspase-3 in der 2-DG- und HCQ-Kombinationsbehandlungsgruppe im Vergleich zur NC-Gruppe, HCQ-Gruppe und 2-DG-Gruppe offensichtlich zunahm (Abbildung S2). Daher wurde vermutet, dass die Kombination von HCQ und 2-DG die Autophagie und Apoptose in 4T1-Zellen verstärken könnte. Darüber hinaus waren die Fluoreszenzintensitäten von LC3 und Cleaved-Caspase-3 in Zellen, die mit 50 mg/kg 2-DG in Kombination mit HCQ behandelt wurden, denen in Zellen ähnlich, die nur mit 100 mg/kg 2-DG behandelt wurden, was zeigt, dass die Zugabe von HCQ könnte die effektive Konzentration von 2-DG verringern (Abbildung S2). Zusammengenommen stützen diese Beobachtungen, dass die Kombinationsbehandlung mit HCQ und 2-DG in vivo eine stärkere Antikrebsaktivität aufweist.

Um die verstärkte Antikrebswirkung der Kombination von HCQ und 2-DG weiter zu untersuchen, wurde Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Beobachtung der Zellmorphologie eingesetzt. Die quantitative statistische Analyse der Anzahl der ER- und autophagischen Vesikel ist in Abb. S3 dargestellt. Nach der Behandlung mit 2-DG nahmen die Elektronendichte, Anzahl und Länge des ER in 4T1- und CMT-7364-Zellen insgesamt zu. Dieses Phänomen steht im Einklang mit früheren Untersuchungen [21]. Nach der kombinierten Behandlung von HCQ und 2-DG war die Länge des ER von 4T1- und CMT-7364-Zellen jedoch in unterschiedlichem Maße verkürzt, während sich die Elektronendichte und -menge kaum veränderte (Abb. 4A). Diese Entdeckung veranlasste uns, die UPR-Wege (Unfolded Protein Response) zu untersuchen, während der PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP-Weg der Hauptweg in der Anaphase von ERS ist und direkt Apoptose induzieren kann [22, 23]. Die gleichzeitige Behandlungsgruppe induzierte im Vergleich zur NC-Gruppe und der Behandlungsgruppe allein die Expression von Grp78, p-PERK, p-eIf-2α, ATF-4 und CHOP dramatisch (Abb. 4B). Insgesamt induziert die Kombination aus HCQ und 2-DG ERS durch Aktivierung des PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP-Signalwegs in 4T1-Zellen und CMT-7364-Zellen.

A Repräsentative TEM-Bilder, die die Ultrastruktur von 4T1- und CMT-7364-Zellen zeigen, die 24 Stunden lang ohne oder mit HCQ, 2-DG oder 2-DG in Kombination mit HCQ behandelt wurden. Rote Pfeile zeigen autophagische Vakuolen an; Blaue Pfeile zeigen das endoplasmatische Retikulum an. Maßstabsbalken: 2 mm (Miniaturansicht), 200 nm (Bild vergrößern). B Western-Blot-Analysen von Grp78, PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α, ATF-4 und CHOP in Zellen, die 24 Stunden lang mit HCQ und 2-DG allein oder in Kombination behandelt wurden. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns = nicht signifikant (p ≥ 0,05).

HCQ kann den pH-Wert von Lysosomen erhöhen, was zu einer Hemmung der Fusion von Lysosomen und Autophagosomen führt und den autophagischen Fluss blockiert [24, 25]. Wie die TEM-Analyse zeigte (Abb. 4A), förderte die Kombinationstherapie deutlich die Zunahme autophagischer Vakuolen. Anschließend wurde die Western-Blot-Analyse verwendet, um die Expression der autophagischen Marker Beclin-1, LC3B-I/II in 4T1- und CMT-7364-Zellen nachzuweisen. Wie in den quantifizierten Ergebnissen (Abb. 5A, B) gezeigt, erhöhte die gleichzeitig behandelte Gruppe die Beclin-1-Spiegel und die LC3B-Lipidierung dramatisch, während die Bilder von fluoreszierenden LC3B-Punkten dieses Ergebnis ebenfalls bestätigten (Abb. 5C, D).

A, B Western-Blot-Analysen von Beclin-1 und LC3B-II in 4T1- und CMT-7364-Zellen, die 24 Stunden lang ohne oder mit HCQ, 2-DG oder 2-DG kombiniert mit HCQ behandelt wurden. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt. **p < 0,01, ****p < 0,0001. C, D Immunfluoreszenzfärbung von LC3B-II in 4T1- und CMT-7364-Zellen, die 24 Stunden lang mit HCQ und 2-DG allein oder in Kombination behandelt wurden. Maßstabsbalken: 10 μm. n = 3 unabhängige Experimente, die für jede Bedingung dreifach durchgeführt wurden und mindestens 30 Zellen bewertet wurden.

Triple-negativer Brusttumor (TNBC) ist ein Sammelbegriff für Brusttumor-Subtypen, denen der Östrogenrezeptor und der Progesteronrezeptor fehlen und die den humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor 2 nicht überexprimieren [26]. Im Vergleich zu Tumoren, die den Östrogenrezeptor, den Progesteronrezeptor und den humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor 2 positiv exprimieren, ist TNBC aggressiver und hat schlechtere Behandlungseffekte und eine schlechtere Prognose [27]. CMT-7364 (Hundeursprung) ist eine Art von TNBC-Zellen mit ähnlichen invasiven und Übertragungseigenschaften wie MDA-MB-231-Zellen (humaner Herkunft) [28]. Zum besseren Vergleich haben wir auch 4T1-Zellen (Maus-Ursprung) untersucht, die ebenfalls ähnliche Eigenschaften wie TNBC aufweisen [29].

Es wurde gezeigt, dass 2-DG, ein Glykolysehemmer, Apoptose in Krebszellen induziert, indem es die Glykolyse und Energieproduktion hemmt und den ERS-Weg aktiviert [13, 30, 31]. Allerdings können nur durch die hochdosierte Behandlung von 2-DG gute Ergebnisse für praktische Anwendungen erzielt werden, was die Verallgemeinerung von 2-DG in gewissem Maße einschränkt. HCQ kann einen Anstieg des pH-Werts in Lysosomen verursachen, was die Fusion von Autophagosomen und Autolysosomen sowie den Abbau der Ladung in Autophagosomen hemmen kann [32]. Hier zeigen wir, dass die kombinierte Behandlung von 2-DG und HCQ zu einem Anstieg der Zellapoptose führt, indem sie ERS induziert und die Autophagie hemmt (Abb. 6).

Die Metaboliten von 2-DG stören die N-verknüpfte Glykosylierung von Proteinen, was zur Akkumulation ungefalteter/fehlgefalteter Proteine ​​im ER führt, gefolgt von ERS, Apoptose und zytoprotektiver Autophagie. HCQ bewirkt eine Entsäuerung der Lysosomen, hemmt die Fusion von Autophagosomen und Lysosomen zur Bildung von Autolysaten, was zur Hemmung des Abbaus fehlgefalteter Proteine ​​führt und weiteren Stress im endoplasmatischen Retikulum induziert, was letztendlich zu einer erhöhten Apoptose führt.

Das Transkriptionsfaktor C/EBP-homologe Protein (CHOP) ist an ERS beteiligt, das die Apoptose über die BCL-2-Proteinfamilie regulieren kann [33]. Unter persistierendem ERS kann CHOP die Expression von Bcl-2, Bcl-XL und Mcl-1 hemmen, die Expression von BIM aktivieren und einen Anstieg von BAX und BAK induzieren [34]. Diese Regulation initiiert die Aktivierung von Caspase-3 und PARP und führt zur Apoptose [35]. In unserer Forschung haben wir herausgefunden, dass HCQ und 2-DG beide die Aktivität von CMT-7364- und 4T1-Zellen in einem konzentrationsabhängigen und zeitabhängigen Gradienten hemmten und die kombinierte Verwendung von HCQ und 2-DG die Hemmwirkung weiter verstärkte (Abb. 1). Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Migrations- und Apoptoserate in TNBC-Zellen beobachtet. Auch der Nachweis apoptotischer Proteine ​​verdeutlicht diesen Punkt (Abb. 2). In orthotopischen Transplantationstumor-Mausmodellen war die therapeutische Wirkung von 100 mg/kg 2-DG allein bei Verwendung von 50 mg/kg 2-DG in Kombination mit der HCQ-Gruppe ähnlich, was beides das Tumorvolumen und -gewicht bis zu einem gewissen Grad reduzierte ( Abb. 3, Abbildung S2). Darüber hinaus zeigte die 2-DG-Gruppe in Kombination mit der HCQ-Gruppe eine signifikantere therapeutische Wirkung als die anderen Gruppen (Abb. 3, S2). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass eine gleichzeitige Behandlung mit 2-DG und HCQ die Apoptose wirksam fördern könnte, indem sie die Autophagie hemmt, um das Tumorwachstum zu hemmen.

Das ER ist das wichtigste Organell in der sekretorischen Funktion eukaryotischer Zellen und ist für die Speicherung von Kalziumionen, den Stoffwechsel von Lipiden und Kohlenhydraten sowie die Faltung von Proteinen verantwortlich. Aufgrund der besonderen Wachstumseigenschaften und Umgebung von Tumorzellen beeinflussen viele stimulierende Faktoren, darunter Hypoxie, Mangel an Aminosäuren und unzureichende Glukoseversorgung, die Proteinverarbeitung im ER. ERS bezieht sich auf eine Zunahme ungefalteter oder fehlgefalteter Proteine, die im ER verursacht wird. Um die Zellhomöostase aufrechtzuerhalten, initiieren Zellen mehrere grundlegende Wege, einschließlich UPR, Abbau im Zusammenhang mit dem endoplasmatischen Retikulum, Autophagie usw. Ob diese Regulierungsprogramme ausreichen, um die Zellfunktion aufrechtzuerhalten, bestimmt, ob die Zelle einen stabilen Zustand wiederherstellen oder den Zelltod aktivieren soll Programm [36,37,38,39]. Der UPR-Signalweg besteht aus drei Hauptzweigen: Proteinkinase R-like ER-Kinase (PERK), Inositol erforderndes Enzym 1 (IRE1) und aktivierender Transkriptionsfaktor 6 (ATF6). Studien haben gezeigt, dass zu Beginn der UPR-Reaktion alle Zweige schnell zum Zytoprotektion aktiviert werden. Während das ERS andauert, werden die IRE1- und ATF6-Signale herunterreguliert, was zu einem Ungleichgewicht führt, während das PERK-Signal weiterhin ausgegeben wird und die Zelle ihrem Untergang entgegenführt [40, 41]. Daher stand der PERK-Weg im Mittelpunkt dieser Studie, wie auch bei anderen Studien (42, 43). Die mikroskopische Charakterisierung von Organellen wurde mittels TEM beobachtet. Die statistischen Analyseergebnisse von TEM sind in Abb. S3 dargestellt. Wir fanden heraus, dass die Anzahl erweiterter ERs in mit HCQ behandelten TNBC-Zellen signifikant erhöht war. Allerdings stiegen nach der 2-DG-Behandlung die Anzahl, die Elektronendichte und die Länge der ER in den Zellen im Vergleich zu NC deutlich an. Interessanterweise war ER in der Gruppe mit gleichzeitiger Behandlung deutlich kürzer, aber seine Anzahl und Elektronendichte blieben auf einem hohen Niveau. Wir stellten die Hypothese auf, dass das ER als Hauptquelle der intrazellulären Plasmamembran Membranquellen für die massiv gebildeten autophagischen Vesikel bereitstellt und dadurch die Länge seiner eigenen Plasmamembran verkürzt (44, 45). Die WB-Ergebnisse zeigten, dass HCQ in Kombination mit 2-DG die ERS-Spiegel über den PERK-eIF2α-ATF-4-CHOP-Weg signifikant erhöhte (Abb. 4).

Von Hefen bis hin zu Säugetieren ist Autophagie ein evolutionär konservierter Prozess [46, 47]. In vielen Tumorzellen wurde ein hohes Maß an Autophagie festgestellt, um das Zellüberleben aufrechtzuerhalten [48, 49]. Autophagie ist am Abbau beschädigter Proteine/Organellen in Zellen beteiligt und wandelt diese in Aminosäuren um [50]. Diese Ergebnisse untermauern die Bedeutung der Autophagie für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. TEM zeigte einen Anstieg autophagischer Vesikel in TNBC-Zellen nach 2-DG-Behandlung im Vergleich zu NC. Frühere Studien haben gezeigt, dass 2-DG die Bildung von Autophagosomen induziert, um die Autophagie zu fördern [51]. In Kombination mit unserer Studie wird spekuliert, dass 2-DG durch Glukosemangel eine schützende Autophagiereaktion auslösen könnte [52,53,54,55]. Daher ist die Blockierung der schützenden Autophagie Gegenstand vieler Studien geworden [56,57,58]. In unserer Studie wurde HCQ eingesetzt, um die schützende Autophagie zu blockieren. In TNBC-Zellen, die mit einer Kombination aus 2-DG und HCQ behandelt wurden, stiegen die Anzahl der autophagischen Vesikel und die Proteinspiegel von Beclin-1 und LC3B-II signifikant an als bei denen, die mit den Einzelmedikamentgruppen behandelt wurden (Abb. 4 und 5). Es wird darauf hingewiesen, dass HCQ die durch 2-DG induzierte schützende Autophagie beendete.

In dieser Studie haben wir die wirksame antitumorale Wirkung der Kombination von 2-DG und HCQ auf TNBC-Zellen sowohl in vivo als auch in vitro gezeigt. Tatsächlich könnte die bemerkenswerte Effizienz ihrer Kombination bei der Beeinflussung der Zelllebensfähigkeit durch Autophagie-Hemmung und kontinuierliche ERS wichtige Auswirkungen auf die Behandlung von Brustkrebs haben.

Die in dieser Studie verwendeten 4T1-Zellen wurden von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) bezogen, und CMT-7364-Zellen, eine aus Brusttumoren von Hunden isolierte Zelllinie, wurden freundlicherweise vom Degui Lin Laboratory am China Agricultural zur Verfügung gestellt Universität [59]. Alle Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden in T25-Zellkulturflaschen kultiviert. Wenn die Zelldichte mehr als 80 % erreichte, wurden die Zellen für die entsprechenden Experimente in 96-Well-Platten oder 6-Well-Platten subkultiviert.

Western Blot und Immunfluoreszenz wurden unter Verwendung der folgenden Antikörper durchgeführt: Phospho-PERK (p-PERK), Phospho-eIF2α (p-eIF2α), gespaltene Caspase-3 (c-Casp3), β-Aktin (Cell Signaling Technologies; Danvers, MA); gespaltenes PARP (c-PARP), CHOP, Bax, Bcl-2, Grp78, PERK, eIF2α, ATF-4, Beclin-1, LC3B-I/II (Abcam, Cambridge, UK). 2-DG (Reinheit ≥98 %) und HCQ (Reinheit >99 %) wurden von Sigma-Aldrich Chemical (Vertreter aus Shanghai, China) bezogen. Das Apoptosis Assay Kit und das FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit mit PI (Propidiumiodid) wurden vom Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China) erworben. Das Cell Counting Kit-8 wurde zum Nachweis der Zelllebensfähigkeit erworben (CCK-8, Dojindo Laboratories, Minato-ku, Tokio, Japan). Alle anderen Chemikalien und Reagenzien waren in höchster kommerzieller Qualität erhältlich.

Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 104 Zellen/ml (37 °C, 12 h) ausgesät. Es gab fünf Wiederholungen für eine Gruppe und unterschiedliche Konzentrationen von 2-DG (0,25, 0,5, 1, 2 oder 4 mM), kombiniert mit oder ohne HCQ (10 μM) und HCQ (5, 10, 20, 40, 80, 120). , 160, 200 oder 400 μM) wurden zugegeben und weitere 24 Stunden inkubiert. In der anderen Versuchsreihe wurden Zellen mit PBS, HCQ (10 μM), 2-DG (1 mM) oder 2-DG (1 mM) kombiniert mit HCQ (10 μM) für verschiedene Zeiten (12, 24, 48 oder 72 Stunden). Sofern nicht anders angegeben, wurde das Kulturmedium mit der gleichen Wirkstoffkonzentration alle 12 Stunden gewechselt. Nach der Behandlung wurden insgesamt 10 µL (5 mg/ml) CCK-8 pro Vertiefung hinzugefügt und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Absorption (optische Dichte) mit einem Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad Instruments, Hercules, CA) bei 450 nm gemessen.

Die Zellmigration wurde wie zuvor beschrieben durch Wundheilungskratztests bewertet. CMT-7364-Zellen und 4T1-Zellen wurden in Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen ausgesät. Als die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichten, wurden mit 200 μl-Kunststoffpipettenspitzen Kratzer gemacht und die Zellen wurden zweimal sorgfältig mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit Opti-MEM (Invitrogen, CA) reduziertem Serummedium, das PBS, HCQ, 2-DG oder 2-DG kombiniert mit HCQ enthielt, 24 Stunden lang stimuliert. Die Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop aufgenommen, das an eine Canon-Kamera angeschlossen war. Zur Messung des Spaltabstands der Wunde wurde die Software ImageJ verwendet.

Apoptosetests wurden unter Verwendung der Doppelfärbung mit Annexin V-FITC (Fluoresceinisothiocyanat) und Propidiumiodid (PI) durchgeführt. CMT-7364-Zellen und 4T1-Zellen wurden 12 Stunden lang in Platten mit 6 Vertiefungen kultiviert. Nachdem die vorgegebene Behandlungsdauer erreicht war, wurden die Zellen zweimal mit vorgekühltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypsin verdaut und 5 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 1000 U/min/min zentrifugiert, zweimal mit vorgekühltem PBS gewaschen und in Bindungspuffer (500 μl) bei einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden vorsichtig gevortext und mit 5 μl Annexin V-FITC und 10 μl Propidiumiodid bei Raumtemperatur für 10 Minuten im Dunkeln gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Die Apoptoseraten wurden mittels Durchflusszytometrie (Becton Dickinson; Franklin Lakes, New Jersey) bestimmt und mit der Software FlowJo 10.6.2 analysiert.

CMT-7364-Zellen und 4T1-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen kultiviert. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit 2,0 % (v/v) Paraformaldehyd und 2,5 % (v/v) Glutaraldehyd in 0,1 M PBS fixiert (4 °C, über Nacht). Die Zellen wurden in PBS gewaschen, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (20 °C) in 1 % Osmiumtetroxid fixiert und dann dreimal in PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen in einer abgestuften Acetonreihe (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % (v/v) Ethanol) dehydriert. Der letzte Schritt wurde zweimal für jeweils 20 Minuten wiederholt. Die Proben wurden in einer 2:1-Mischung aus Aceton und Epon über Nacht bei 37 °C permeabilisiert, dann 8 Stunden lang bei 37 °C in Aceton in Epon (1:1-Mischung) und schließlich über Nacht bei 37 °C in reines Epon gelegt. Anschließend wurden die Zellen zur Polymerisation bei 60 °C in eine Gießform überführt. Die Proben wurden auf eine Dicke von 80 μm geschnitten (Leica, Wetzlar, Deutschland). Die Schnitte wurden in ein Kupfergitter gelegt und mit 2 % Uranacetat und Bleicitrat gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet und mit einem Transmissionselektronenmikroskop (Hitachi, Tokio, Japan) untersucht.

Die Western-Blot-Analyse (WB) wurde gemäß den vorherigen Methoden durchgeführt und wie folgt kurz beschrieben. Das Gesamtprotein der Zellen wurde mit einer RIPA-Lyselösung mit PMSF und Phosphataseinhibitoren (BioSharp, Hefei, China) geerntet. Probenproteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membran wurde 2 Stunden lang in 5 % Magermilch blockiert, gefolgt von einer Behandlung mit primärem Antikörper und sekundärem Antikörper. Proteine ​​wurden mit einem ChemiDoc MP-Bildgebungssystem (Bio-Rad, USA) sichtbar gemacht und die Proteinexpression mit der ImageJ-Software analysiert.

Die Immunfluoreszenzfärbung (IF) wurde gemäß den vorherigen Methoden durchgeführt und wie folgt kurz beschrieben. CMT-7364-Zellen und 4T1-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen/ml kultiviert. Nach der Behandlung wurden die Zellen 30 Minuten lang mit 4 % (v/v) Paraformaldehyd fixiert und 20 Minuten lang mit 0,5 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen 2 Stunden lang mit 5 % BSA blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert. FITC-markiertes oder Cy3-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) wurde verwendet, um die Zellen 1 Stunde lang im Dunkeln zu inkubieren und mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Beyotime, China) für den Kern anzufärben 2 Min. gegenfärben. In diesem Experiment wurden die Zellen zwischen jeder Behandlung dreimal mit PBS gewaschen. Die Bilder wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) beobachtet.

Sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (16–18 g) wurden eine Woche vor den Experimenten vom Versuchstierzentrum der Provinz Hubei der Huazhong Agricultural University (Wuhan, China) gekauft. Die Versuchstiere wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Ethical Committee for Animal Care and Use der Huazhong Agricultural University und der United States National Institutes of Health gepflegt und verwendet. Ungefähr 5 × 107 4T1-Zellen wurden gesammelt und in 2,5 ml PBS suspendiert und dann subkutan in das vierte Brustpolster der Mäuse injiziert. Zwei Wochen nach der Injektion entwickelten die Mäuse deutliche Knoten. Diese Mäuse wurden in fünf Gruppen randomisiert und allen wurden verschiedene Medikamente intraperitoneal injiziert. Die Mäuse der ersten Gruppe wurden mit HCQ (50 mg/kg, jeden zweiten Tag für 25 Tage) behandelt. Die Mäuse der zweiten Gruppe wurden mit 2-DG (100 mg/kg, jeden zweiten Tag für 25 Tage) behandelt. Die Mäuse in der dritten Gruppe wurden gleichzeitig mit 1/2 2-DG (50 mg/kg, jeden zweiten Tag für 25 Tage) und HCQ (50 mg/kg, jeden zweiten Tag für 25 Tage) behandelt. Die Mäuse in der vierten Gruppe wurden gleichzeitig mit 2-DG (100 mg/kg, jeden zweiten Tag für 25 Tage) und HCQ (50 mg/kg, jeden zweiten Tag für 25 Tage) behandelt. Die letzte Gruppe wurde als Kontrollgruppe mit PBS behandelt. Das Tumorvolumen und das Körpergewicht wurden alle 2 Tage gemessen. Tumorvolumen (V) = 0,5 × Länge × Breite2. Schließlich wurden die Mäuse am Ende des Experiments auf humane Weise getötet, die Tumore wurden entnommen und gewogen, und wichtige lebenswichtige Organe wie Leber, Lunge, Milz, Herz und Niere jeder Gruppe wurden entnommen und in 4 % Paraformaldehyd fixiert.

Tumore und Organe wurden anschließend dehydriert und 48 Stunden nach der Fixierung in Formaldehyd in Paraffin eingebettet und später zur Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) in 5 µm dicke Scheiben geschnitten. Zur Bilderfassung wurde ein optisches Mikroskop (Olympus, Japan) verwendet. Die Tumorschnitte wurden auch zur Immunfluoreszenzfärbung verwendet.

Die Tumorschnitte wurden auch zur Immunfluoreszenzfärbung verwendet. Nach dem Entparaffinieren mit Xylol und einem Gradienten von Ethanol zu Wasser wurden die Tumorabschnitte in Zitronensäure-Antigen-Reparaturpuffer (pH 6,0) getaucht und zur Antigen-Reparatur in einem Mikrowellenofen erhitzt. Anschließend wurden die Tumorschnitte einem ähnlichen Verfahren wie Schritt 2.8 unterzogen, einschließlich Blockierung mit Ziegenserum, Inkubation mit primären und sekundären Antikörpern, Gegenfärbung mit DAPI und Versiegelung mit Anti-Fluoreszenzlöschungs-Versiegelungstabletten. Die Bilder wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) beobachtet.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) von mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine Zwei-Wege-Varianzanalyse oder einen ungepaarten Student-t-Test (GraphPad Prism 8) berechnet. Ein Wert von *p < 0,05 wurde als signifikant angesehen, und **p < 0,01, ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 galten als äußerst signifikant. Ein Wert von p > 0,05 (ns) wurde als nicht signifikant angesehen.

Alle Daten sind im Haupttext oder in den ergänzenden Materialien verfügbar.

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Die Autoren danken Prof. Degui Lin (China Agricultural University, Peking, China) für die Bereitstellung der CMT-7364-Zelllinie.

Projekt unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32172925).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ning Zhou, Qingyun Liu.

Abteilung für klinische Veterinärmedizin, Hochschule für Veterinärmedizin, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, 430070, China

Ning Zhou, Xiao Wang, Lixin He, Han Zhou, Xinying Zhu, Tianhong Zhou, Ganzhen Deng und Changwei Qiu

Staatliches Schlüssellabor für landwirtschaftliche Mikrobiologie, Hochschule für Veterinärmedizin, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, 430070, China

Qingyun Liu

Abteilung für klinische Veterinärmedizin, Hochschule für Tierwissenschaften und -technologie, Anhui Agricultural University, Hefei, 230036, China

Tao Zhang

Abteilung für Tierwissenschaften und -technologie, Shanghai Agriculture and Forestry Vocational College, Shanghai, 201699, China

Xinying Zhu

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Konzeptualisierung: NZ und QL; Methodik: NZ, QL und XW; Projektverwaltung: NZ, QL, LH, TZ (Tao Zhang), HZ, XZ und TZ (Tianhong Zhou); Schreiben – Originalentwurf: NZ, QL und XW; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: NZ, QL, GD und CQ. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Changwei Qiu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhou, N., Liu, Q., Wang, X. et al. Die Kombination von Hydroxychloroquin und 2-Desoxyglucose verstärkt die Apoptose in Brustkrebszellen, indem sie die schützende Autophagie blockiert und den Stress des endoplasmatischen Retikulums aufrechterhält. Zelltod-Entdeckung. 8, 286 (2022). https://doi.org/10.1038/s41420-022-01074-6

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Eingegangen: 05. März 2022

Überarbeitet: 12. Mai 2022

Angenommen: 27. Mai 2022

Veröffentlicht: 11. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41420-022-01074-6

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Zelluläre und molekulare Lebenswissenschaften (2022)