Integrin

Jul 28, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 680 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Axone der retinalen Ganglienzellen (RGC) laufen auf der Papille zusammen und bilden einen Sehnerv. Der Mechanismus der RGC-Axonkonvergenz bleibt jedoch unklar. In der embryonalen Netzhaut existiert ein elektrisches Feld (EF), und dieses EF konvergiert auf der zukünftigen Papille. In vitro wurde gezeigt, dass EFs Axone zur Kathode hin ausrichten. Hier zeige ich, dass der EF RGC-Axone auf extrazelluläre Ca2+-abhängige Weise durch Integrin dirigiert. Das kathodische Wachstum embryonaler Hühner-RGC-Axone, die Integrin α6β1 exprimieren, wurde durch monoklonale Anti-Hühner-Integrin-β1-Antikörper verstärkt. Mn2+ hob diese EF-Effekte auf, da Mn2+ die Ca2+-abhängige negative regulatorische Stelle in der β1-Untereinheit besetzt, um die Ca2+-Hemmung zu eliminieren. Die vorliegende Studie schlägt ein Integrin-vermitteltes elektrisches Axon-Steuerungsmodell vor, das gerichtete Ca2+-Bewegungen und eine asymmetrische Mikrotubuli-Stabilisierung beinhaltet. Da Neuroepithelzellen während der Neurogenese EFs erzeugen, kann die elektrische Axonführung hauptsächlich bei der Entwicklung des Zentralnervensystems eingesetzt werden.

Während der Entwicklung des Zentralnervensystems (ZNS), einschließlich der Netzhaut, strecken die erstgeborenen Neuronen über weite Strecken wandernde Axone wie Kommissuraxone und Sehnerven aus, obwohl der Orientierungshinweis für diese langen, ersten Axone unbekannt bleibt. Die vorherrschende Meinung ist derzeit, dass Wachstumskegel Konzentrationsgradienten von Chemoattraktoren mit großer Reichweite erkennen. Aufgrund grundlegender physikalischer Grenzen der Gradientenerkennung ist es jedoch unwahrscheinlich, dass Gradienten allein einen Richtungshinweis mit hoher Wiedergabetreue liefern1. Eigentlich wurde Netrin zunächst als diffusionsfähiger, weitreichender Chemoattraktant für Kommissuralaxone vorgeschlagen, doch spätere Studien ergaben, dass es lokal wirkt, indem es die Adhäsion von Wachstumskegeln im Gehirn und Rückenmark fördert2, oder als Signal mit kurzer Reichweite an der Papille3 .

Wachsende Axone werden nicht nur durch chemische Signale, sondern auch durch elektrische Felder (EFs) in einem Prozess namens Galvanotropismus gesteuert4. Der erste experimentelle Beweis für dieses Phänomen wurde vor über einem Jahrhundert, im Jahr 19205, nach der Erfindung der Gewebekulturtechnik6, gemeldet. Die physiologische Relevanz der elektrischen Axonführung bleibt jedoch aus zwei Gründen umstritten: (1) weil es kaum In-vivo-Beweise für ihre Bedeutung gibt und (2) weil die molekularen Mechanismen etwas unklar sind.

Die Netzhaut ist ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Entwicklung des ZNS. In der embryonalen Netzhaut von Hühnern gibt es einen extrazellulären Spannungsgradienten, der durch den Natriumtransport von Neuroepithelzellen erzeugt wird7,8. Dieser EF konvergiert auf der zukünftigen Papille und ist für die korrekte Ausrichtung der RGC-Axone7 von wesentlicher Bedeutung. Daher besteht die Möglichkeit, dass der EF als Orientierungshilfe für RGC-Axone fungiert. Diese Möglichkeit wurde in der vorliegenden Studie anhand der embryonalen Hühnernetzhaut untersucht. Die molekularen Mechanismen wurden ebenfalls auf der Grundlage der folgenden Überlegungen untersucht.

Ein EF verursacht gerichtete Bewegungen von Ionen im extrazellulären Raum. Diese Ionenbewegungen können ein Richtungshinweis sein, da EF-bewegte Ionen auf der anodischen und kathodischen Seite eines Axons unterschiedlich auf Zelloberflächenmoleküle treffen. Die sich bewegenden Ionen können das Zelloberflächenmolekül, das die Axonsteuerung auslöst, asymmetrisch regulieren. Als Kandidatenmolekül für diese Rolle wurde Integrin aus folgenden Gründen in Betracht gezogen: (1) embryonale RGC-Axone von Hühnern exprimieren Integrin α6β19, (2) die Affinität von Integrin für den Liganden der extrazellulären Matrix (ECM) wird dynamisch durch das extrazelluläre Ca2+ reguliert der physiologische Konzentrationsbereich10,11, (3) der Verlust von Integrin führt zu einer Desorganisation der RGC-Axone12, (4) Integrin vermittelt die EF-induzierte gerichtete Zellmigration13,14,15,16 und (5) eine Verringerung des extrazellulären Ca2+ wirkt als ein Anhaltspunkt für die Integrin-vermittelte Zellmigration während der Wundheilung17. Die vorliegende Studie zeigt, dass die EF RGC-Axone durch Integrin ausrichtet und schlägt ein Ca2+-abhängiges Axon-Steuerungsmodell vor. Die Rolle von EFs bei der ZNS-Entwicklung wird diskutiert.

Netzhautstreifen embryonaler Küken vom 6. Tag (E6) wurden aus dem Segment explantiert, das ursprünglich dorsal zum Sehnervenkopf lag (Abb. 1a, b). Sie wurden in Matrigel® eingebettet, da Matrigel® und die optische Faserschicht den ECM-Liganden für Integrin18,19 enthalten. Da die Ausrichtung der aus dem Netzhautstreifen herauswachsenden RGC-Axone das Muster des Axonwachstums während der normalen Entwicklung in vivo widerspiegelt20, traten zahlreiche Axone aus der ventralen Seite der Netzhautstreifen hervor, wie die Fluoreszenzbildgebung lebender Axone zeigt (Abb. 1c, z. B ). Es war wahrscheinlich, dass sich die Axone, die bereits vor dem Explantat ausgerichtet waren, nach ventral erstreckten20,21. Die RGC-Axone erschienen bevorzugt im zentralen Teil der Netzhautstreifen, wo die Dichte der RGCs hoch ist22. Die ventrale Ausdehnung wurde anhand der Fluoreszenzintensität quantifiziert (ventrale Ausdehnungsrate, VER, Abb. 1c, d).

a Ein Netzhautstreifen wurde aus dem Segment dorsal des Sehnervenkopfes der Netzhaut eines embryonalen Kükens am 6. Tag (E6) explantiert. b Der Netzhautstreifen wurde mit einem keilförmigen Membranfilter fixiert, der zwischen der schrägen Nasenkante des Netzhautstreifens und der Wand der Kulturkammer eingesetzt wurde. Die Schläfenkante berührt die gegenüberliegende Wand. c Ein Netzhautstreifen, der 24 Stunden lang ohne EF inkubiert wurde. Lebende Zellen und RGC-Axone wurden mit Calcein-AM fluoreszierend markiert. RGC-Axone erstreckten sich vom ventralen Rand des Netzhautstreifens. Horizontale Linien geben den Abstand vom ventralen Rand an. d Die an den Linien in (c) gemessene mittlere Fluoreszenzintensität wurde gegen den Abstand vom ventralen Rand aufgetragen. Die ventrale Ausdehnungsrate (VER) ist das Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensität zwischen den Linien 150 μm und 400 μm ventral des Netzhautstreifens, angezeigt durch das Rechteck in (c), gegenüber der Hintergrundintensität, die in dem durch das Quadrat angezeigten Bereich ohne Netzhaut gemessen wird oben rechts in (c). e RGC-Axone, die sich vom ventralen Rand im zentralen Teil des Netzhautstreifens in (c) erstrecken. f RGC-Axone, kultiviert im ventral gerichteten EF (Pfeil nach unten). g RGC-Axone, kultiviert mit EF und TASC (100 μg/ml). h RGC-Axone, kultiviert mit EF und W1B10 (100 μg/ml). i RGC-Axone, kultiviert mit EF und dem Kontrollantikörper IgG1 (200 μg/ml). j RGC-Axone, kultiviert im dorsal gerichteten EF (Pfeil nach oben). k VERs (Mittelwert ± Standardabweichung) von kultivierten Netzhautstreifen (von links), ohne EF (nein, n = 24 Fotos, aufgenommen mit unterschiedlichen Fokusstufen von 4 Netzhautstreifen); mit ventral gerichtetem EF (Pfeil nach unten, n = 18 aus 3 Netzhautstreifen); mit EF und TASC (100 μg/ml, n = 18 aus 3 Netzhautstreifen); mit EF und W1B10 (100 μg/ml, n = 18 aus 3 Netzhautstreifen); mit EF und dem Kontrollantikörper (200 μg/ml, n = 18 aus 3 Netzhautstreifen); mit dem nach dorsal gerichteten EF (Pfeil nach oben, n = 24 aus 4 Netzhautstreifen). Horizontale Balken und Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (zweiseitiger t-Test, **P < 0,001). l Dosis-Wirkungs-Beziehungen zwischen der Antikörperkonzentration (TASC, W1B10) und VER (Mittelwert ± Standardabweichung) von Netzhautstreifen, die im ventral gerichteten EF kultiviert wurden (n = 18 aus 3 Netzhautstreifen für jeden Punkt). VERs bei 0 und 100 μg/ml wurden aus (k) neu aufgetragen. m Ein Netzhautstreifen, der im dorsal gerichteten EF kultiviert wurde. Die Hintergrundintensität wurde erhöht, um die Axone auf der dorsalen Seite sichtbar zu machen. Die Axone auf der ventralen Seite sind in (j) auf normalem Hintergrundniveau dargestellt.

Wachsende Axone werden durch EF zur Kathode gelenkt4,21,23,24. Die ventrale Ausdehnung nahm im ventral gerichteten EF zu, dessen Stärke bei 15 mV/mm gehalten wurde, um den In-vivo-EF7 nachzuahmen (Abb. 1f, k). Umgekehrt nahm sie in der nach dorsal gerichteten EF ab (Abb. 1j, k), was als anodische Unterdrückung bekannt ist23. Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass der EF die Axone neugeborener RGCs oder nicht ausgerichteter Axone zur Kathode lenkte und auch die ventral wachsenden Axone neu ausrichten könnte. Die dorsalen Axone schienen im Umkehr-EF zuzunehmen, obwohl sie nicht analysiert wurden, da die Hintergrundintensität erhöht werden musste, um sie sichtbar zu machen (Abb. 1m).

Um zu untersuchen, ob Integrin an der elektrischen Wirkung beteiligt war, wurden Netzhautstreifen in Kulturmedium mit dem monoklonalen Anti-Hühner-Integrin-β1-Antikörper TASC25 vorinkubiert und dann in Matrigel® mit TASC eingebettet. Die ventrale Ausdehnung zur Kathode hin wurde dosisabhängig verstärkt (Abb. 1g, k, l). Ein weiterer monoklonaler Anti-Hühner-Integrin-β1-Antikörper, W1B1026, verstärkte das Kathodenwachstum bei niedrigen Konzentrationen (≤ 50 μg/ml, Abb. 1h, k, l) ebenfalls wirksamer als TASC. Der negative Kontrollisotyp-Antikörper-Maus-IgG1 verstärkte das kathodische Wachstum selbst bei einer hohen Konzentration (200 μg/ml, Abb. 1i, k) nicht. TASC und W1B10 erhöhten auch die ventrale Ausdehnung ohne EF (ergänzende Abbildung 1b – d), während der Negativkontroll-Isotyp-Antikörper-Maus-IgG1 die ventrale Ausdehnung ohne EF nicht erhöhte (ergänzende Abbildung 1a, d). Trotz der Tatsache, dass TASC und W1B10 die Basalverlängerung erhöhten, waren die Anstiege von VER mit EF im Vergleich zu ohne EF [(VERs mit EF) − (mittlerer VER ohne EF), EF-Index, EFI] größer als bei der Kontrolle ohne die Antikörper ( Ergänzende Abbildung 1e). Somit vermittelte Integrin EF-Effekte, es bestand jedoch weiterhin die Möglichkeit, dass Integrin die Axonverlängerung selbst regulierte, ohne an der Axonorientierung beteiligt zu sein. Um zu untersuchen, ob Integrin an der elektrischen Ausrichtung von Axonen beteiligt ist, wurde in den folgenden Abschnitten die Rolle von Ca2+ bei der Integrinregulation untersucht.

Die Ligandenbindungsdomäne der Integrin-β1-Untereinheit enthält die Ca2+-abhängige negative regulatorische Stelle mit der Bezeichnung ADMIDAS11. Die Bindung von Ca2+ an ADMIDAS verändert das Integrin in die geschlossene Konformation, um die Ligandenbindung zu hemmen11. Da der EF Ca2+ in der gelatineartigen ECM bewegt, ist es möglich, dass das gerichtet bewegte Ca2+ Integrin asymmetrisch an der Axonoberfläche reguliert. Um diese Möglichkeit zu prüfen, wurde Mn2+ dem Vorinkubationsmedium Matrigel® und dem Kulturmedium zugesetzt, da Mn2+ ADMIDAS besetzt und Integrin in der offenen Konformation stabilisiert, um eine hohe Integrin-Ligand-Affinität aufrechtzuerhalten11. Mn2+ bei 500 μM hob den elektrischen Effekt auch in Gegenwart von TASC oder W1B10 auf (Abb. 2a – g, ergänzende Abb. 2a).

a RGC-Axone, kultiviert mit 500 μM Mn2+. b RGC-Axone, kultiviert mit 500 μM Mn2+ im ventral gerichteten EF. c RGC-Axone, kultiviert mit 500 μM Mn2+ und TASC (100 μg/ml). d RGC-Axone, kultiviert mit 500 μM Mn2+ und TASC (100 μg/ml) im ventral gerichteten EF. e RGC-Axone, kultiviert mit 500 μM Mn2+ und W1B10 (100 μg/ml). f RGC-Axone, kultiviert mit 500 μM Mn2+ und W1B10 (100 μg/ml) im ventral gerichteten EF. g VERs (Mittelwert ± Standardabweichung) von Netzhautstreifen, kultiviert mit 500 μM Mn2+ (von links), ohne EF (nein); mit dem nach ventral gerichteten EF (EF); ohne EF und mit TASC (no/TA); mit EF und TASC (EF/TA); ohne EF und mit W1B10 (no/WB); mit EF und W1B10 (EF/WB). Jede Spalte stellt den Wert dar, der aus 18 Fotos stammt, die mit unterschiedlichen Fokusstufen von 3 Netzhautstreifen aufgenommen wurden. Horizontale Balken und Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (zweiseitiger t-Test, **P < 0,001). h, i Eine ganze E4-Retina, 24 Stunden lang ohne Mn2+ kultiviert (einen Tag in vitro, 1 DIV). h RGC-Axone im zentralen Bereich dorsal des Sehnervenkopfes. i RGC-Axone im dorso-nasalen Bereich, die sich bis zum Sehnervenkopf erstrecken (unten links). j, k Eine ganze E4-Retina, 24 Stunden lang mit 500 μM Mn2+ kultiviert. j RGC-Axone im zentralen Bereich dorsal des Sehnervenkopfes. k RGC-Axone in der dorso-nasalen Region, die sich zufällig erstrecken. Gelbe Pfeilspitzen weisen auf abnormale Axonbahnen hin. l, m Ein Netzhautstreifen, kultiviert in einer fokussierten EF. l Die ventrale Seite des Netzhautstreifens ist der offenen Seite eines fächerförmigen Mikrofluidikchips mit dem zentralen Kanal zugewandt, durch den ein Strom von 56 μA zur Kathode floss. Die herauswachsenden Axone liefen auf dem Kanal zusammen und drangen in ihn ein. m Ein stark vergrößertes Bild der konvergierenden Axone in (l). n, o Ein Netzhautstreifen, kultiviert mit 500 μM Mn2+ im gleichen fokussierten EF. n Die ventrale Seite des Netzhautstreifens. o Ein stark vergrößertes Bild von (n). Die EF-Stärke bei Anwendung von 56 μA wurde auf 9 mV/mm rund um den Netzhautstreifen und am Eingang des Kanals auf 300 mV/mm geschätzt (siehe „Methoden“).

Wenn die Konzentration von Mn2+ auf 1,0 mM (elf getestete Netzhäute) und 1,5 mM (fünf getestete Netzhäute) erhöht wurde, wurde das ventrale Auswachsen unterdrückt (ergänzende Abbildung 2b). Stattdessen wurden lokale Arborisierungen innerhalb des Netzhautstreifens gefunden (ergänzende Abbildung 2c). Diese Ergebnisse mit hohem Mn2+-Gehalt können darauf hindeuten, dass die Axonverlängerung die Dissoziation des Integrins vom Liganden erfordert (wird später besprochen).

Um zu untersuchen, ob die Ca2+-Regulation von Integrin der korrekten Ausrichtung der RGC-Axone in vivo zugrunde liegt, wurde Mn2+ auf die organotypische Kultur der gesamten neuralen Netzhaut von E4-Küken angewendet. In den Kontrollnetzhäuten, die 24 Stunden lang ohne Mn2+ inkubiert wurden, waren die RGC-Axone im zentralen Bereich in der Nähe des Sehnervenkopfes und außerhalb des zentralen Bereichs korrekt ausgerichtet (Abb. 2h, i, vier getestete Netzhäute). Im Kulturmedium mit 500 μM Mn2+ waren die Axone in der Nähe des Sehnervenkopfes korrekt ausgerichtet (Abb. 2j), wohingegen chaotische Verlängerungen außerhalb des zentralen Bereichs gefunden wurden (Abb. 2k, gelbe Pfeilspitzen, sieben getestete Netzhäute). Diese abnormalen Flugbahnen könnten auf eine schädliche Wirkung von Mn2+ zurückzuführen sein. Die Tatsache, dass RGC-Axone sich normalerweise in der zentralen Region ausgedehnt hatten, konnte einen solchen Effekt jedoch ausschließen. Da sich RGC-Axone erstmals in der zentralen Region entwickeln27, schienen die Axone in der Nähe des Sehnervenkopfes bereits vor der Zugabe von Mn2+ korrekt ausgerichtet gewesen zu sein. Daher wurde die Bindung von Ca2+ an ADMIDAS als wesentlich für die korrekte Ausrichtung der RGC-Axone in vivo angesehen. Die gleichen Ergebnisse wurden in der vorherigen Studie7 beobachtet, in der die endogene EF durch die Anwendung von Amilorid auf die organotypische Kultur unterdrückt wurde, um epitheliale Natriumkanäle von Neuroepithelzellen zu blockieren8. Aufgrund der vorherigen und aktuellen Ergebnisse schien es wahrscheinlich, dass der endogene EF RGC-Axone auf extrazelluläre Ca2+-abhängige Weise durch Integrin steuert.

Unter der Annahme, dass der endogene EF RGC-Axone zum Sehnervenkopf leitet, könnte der Stamm eines Sehnervs in vitro durch Fokussierung des EF reproduziert werden. Um diese Idee zu testen, wurde ein Netzhautstreifen vor einem fächerförmigen Mikrofluidikchip platziert (ergänzende Abbildung 3), dessen zentraler Kanal (0,2 mm breit) den Stromfluss zur Kathode ermöglichte. Im fokussierten EF konvergierten RGC-Axone und traten in den Kanal ein (fünf Netzhäute, getestet bei 56 μA, Abb. 2l, m; zwei Netzhäute, getestet bei 6, 0 μA bzw. 0, 6 μA, ergänzende Abb. 4a – d). Auch ohne den exogenen Strom sammelten sich RGC-Axone und gelangten in den Kanal, indem sie den Kanal mit dem Kulturmedium mit überschüssigem Volumen verbanden, z. B. durch elektrische Erdung (zwei getestete Netzhäute, ergänzende Abb. 4e, f). Diese Tatsache könnte durch den aktiven Ionentransport des retinalen Neuroepithels selbst erklärt werden (siehe Diskussion). Wenn der Ausgang des Kanals mit einem Gummistopfen blockiert wurde, um jegliche Ionenströme zu verhindern, konvergierten die RGC-Axone nicht (drei getestete Netzhäute, ergänzende Abbildung 4g, h). Mn2+ hob auch die Axonkonvergenz auf (drei Netzhäute, getestet bei 56 μA, Abb. 2n, o). Diese Ergebnisse stützen nachdrücklich die Idee, dass RGC-Axone elektrisch zur zukünftigen Papille gelenkt werden7.

Um die RGC-Axonkonvergenz in fokussierten EFs zu quantifizieren, wurde eine Mikrokanalkammer entworfen (ergänzende Abbildung 5). Im fokussierten EF konvergierten RGC-Axone durch Anlegen eines Stroms von 120 μA auf dem Mikrokanal (Abb. 3a). Der Konvergenzwinkel (CA) wurde an den Axonen gemessen, die sich direkt von der Nasen- und Schläfenregion in Richtung des Mikrokanals erstreckten (ergänzende Abbildung 6a, Abbildung 3d). Die Fluoreszenzintensitäten innerhalb von CA wurden an der Halbabstandslinie zwischen der Netzhaut und dem Mikrokanal gemessen (ergänzende Abbildung 6a, d). Die Gesamtsumme dieser Fluoreszenzintensitäten wurde als weiterer Parameter der Axonkonvergenz berechnet (FCA, Abb. 3e). Darüber hinaus wurde FCA durch die Anzahl der Pixel der Halbdistanzlinie dividiert, um die mittlere Fluoreszenzintensität bei einem Pixel als Index der Axondichte zu erhalten (mittlerer FCA, Abb. 3f). Um festzustellen, ob Integrin die RGC-Axon-Konvergenz vermittelt, wurden W1B10 und Mn2+ getestet. W1B10 (100 μg/ml) erhöhte CA, FCA und den mittleren FCA (Abb. 3b, d–f, ergänzende Abb. 6b, e), wohingegen Mn2+ bei 100 μM sie verringerte (Abb. 3c, d–f, ergänzende Abb . 6c, f). Ohne Anlegen von Strömen dehnten sich RGC-Axone ohne Konvergenz aus (drei getestete Netzhäute, ergänzende Abbildung 6g). Mn2+ bei 500 μM hob die Axonkonvergenz vollständig auf (drei getestete Netzhäute, ergänzende Abbildung 6h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Integrin die elektrische Ausrichtung von RGC-Axonen und deren Konvergenz im fokussierten EF vermittelt.

a–c RGC-Axone, die sich vom ventralen Rand von Netzhautstreifen erstrecken, die in einem fokussierten EF durch Anlegen eines Stroms von 120 μA kultiviert wurden. a RGC-Axone, kultiviert ohne Medikament. b RGC-Axone, kultiviert mit W1B10 (100 μg/ml). c RGC-Axone, kultiviert mit 100 μM Mn2+. d Konvergenzwinkel (CA, Mittelwert ± Standardabweichung) von RGC-Axonen, die im fokussierten EF ohne Medikament (Forts.), mit W1B10 (WB) und 100 μM Mn2+ (Mn2+) kultiviert wurden. CA ist der Winkel zwischen den Axonen, die sich direkt vom Nasen- und Schläfenbereich des Netzhautstreifens erstrecken (gelbe Linien in der ergänzenden Abbildung 6a – c). Jede Spalte stellt den Wert dar, der aus 18 Fotos stammt, die mit unterschiedlichen Fokusstufen von 3 Netzhautstreifen aufgenommen wurden. e Summe der Fluoreszenzintensitäten innerhalb von CA (FCA, Mittelwert ± Standardabweichung). Die Fluoreszenzintensitäten wurden an der Halbabstandslinie zwischen der Netzhaut und dem Mikrokanal gemessen (Cyan-Linien in der ergänzenden Abbildung 6a – c). Ihre Gesamtsumme wurde aus den Querprofilen berechnet (Ergänzende Abbildung 6d – f). Die Daten wurden aus den in (d) verwendeten Fotos gewonnen. f Mittlere Fluoreszenzintensitäten innerhalb von CA (mittlerer FCA, Mittelwert ± Standardabweichung). FCA wurde durch die Anzahl der Pixel der Halbstreckenlinie dividiert. Horizontale Balken und Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (zweiseitiger t-Test, *P < 0,01, **P < 0,001). Die EF-Stärke bei Anwendung von 120 μA wurde auf 20 mV/mm rund um den Netzhautstreifen und am Eingang des Mikrokanals auf 300 mV/mm geschätzt (siehe „Methoden“).

Um die Ca2+-Dynamik um ein Axon in einem EF aufzuzeigen, wurden Ca2+-Bewegungen an der anodischen und kathodischen Seite eines Axons abgebildet. Zu diesem Zweck wurde ein anionischer Ca2+-empfindlicher Fluoreszenzfarbstoff (CalbryteTM−520L, Kd: 90 μM) in der Matrigel®-basierten Dünnschicht-Dissoziationskultur verwendet. Ein einzelnes Axon wurde auf dem konfokalen Mikroskopsystem mit hoher Vergrößerung im Durchlicht identifiziert (ergänzende Abbildung 7). Die Fluoreszenz wurde an den Axonen gemessen, die senkrecht zur Richtung von EF standen, da man annahm, dass die Axonoberfläche als Abschirmung für EF-bewegtes Ca2+ dienen würde. Wachstumskegel wurden für diese Messung nicht ausgewählt, da ihre feinen Vorsprünge im Durchlicht nicht identifiziert werden konnten. Um die Sättigung der Ca2+-empfindlichen Fluoreszenz zu vermeiden, wurde die Matrigel®-Dünnschicht mit einer Ca2+-freien Lösung gewaschen. Eine Mikropipette mit 1 mM CaCl2 und 10 mM CalbryteTM-520L wurde auf der Anodenseite des Axons positioniert (Abb. 4a). Ca2+ diffundierte aus der Pipette in den extrazellulären Raum mit niedrigem Ca2+-Gehalt. Freies CalbryteTM-520L wurde iontophoretisch abgegeben, indem während des gesamten Experiments ein konstanter Strom (–200 nA) geleitet wurde. Nach der Identifizierung des Axons durch negative Färbung (Abb. 4b – d) wurde der EF gestoppt und die Fluoreszenz um das Axon herum nahm ab. Dann wurde ein Test-EF angelegt und die Fluoreszenz nahm auf beiden Seiten zu (Abb. 4e, f). Diese Anstiege schienen auf EF-bewegtes Ca2+ zurückzuführen zu sein, da die Fluoreszenz abnahm, wenn die Richtung des Test-EF umgekehrt wurde (ergänzende Abbildung 8a, b, n = 5 Axone). Der Integralwert des Anstiegs der Fluoreszenzintensität während des Vorwärtstests EF war auf der Anodenseite größer als auf der Kathodenseite; Der Mittelwert der Anoden-/Kathodenverhältnisse betrug 111,7 ± 1,0 % (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 12 Axone aus vier unabhängigen Experimenten, zweiseitiger t-Test, P < 0,001, Abb. 4g). Diese Verhältnisse übertrafen den Mittelwert der Anoden-/Kathodenverhältnisse der Fluoreszenzintensitäten vor der EF-Anwendung (106,4 ± 0,6 %, Mittelwert ± Standardabweichung, n = 12, Abb. 4g, blaue horizontale Linie, vgl. ergänzende Abb. 8c). Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass die Anodenoberfläche eines Axons bei der gerichteten Bewegung von Ca2+ häufiger auf EF-bewegtes Ca2+ trifft als die Kathodenoberfläche. Die Begegnung von Ca2+ wäre im begrenzten in vivo ECM28 asymmetrischer.

a Ein Transmissionsbild eines RGC-Axons, kultiviert in einer Matrigel®-basierten Dünnschicht-Dissoziationskultur. Eine Mikropipette mit 1 mM CaCl2 und 10 mM CalbryteTM-520L wurde auf der Anodenseite des Axons positioniert. b Ein vergrößertes Bild des Axons in (a). c Ein negatives Färbebild des RGC-Axons in (b). CalbryteTM-520L diffundierte in den extrazellulären Raum. Das horizontale Streifenmuster war auf die Drehung der Nipkow-Scheibe im konfokalen Scanner zurückzuführen. d Das Querprofil eines Linienscans an der horizontalen blauen Linie in (c) (blau) und das Querprofil des gesamten Fluoreszenzbilds von (c) (schwarz), dargestellt mit mittlerer Fluoreszenzintensität/Pixel. e, f Ca2+-Fluoreszenzaufzeichnungen von der anodischen (e) und kathodischen (f) Seite des Axons in (c). Einschübe zeigen jeden Aufnahmebereich in Hellgrün im gleichen Maßstab wie in (c). Die Fluoreszenzintensität wird mit 64-Bit-Tiefe dargestellt. g Anoden-/Kathodenverhältnis der Integralwerte der Zunahmen der Fluoreszenzintensität während EF (Fluoreszenzintensität × Zeit), aufgetragen gegen die an zwölf RGC-Axonen gemessenen Kathodenwerte. Die horizontale blaue Linie zeigt das mittlere Anoden-/Kathodenverhältnis der Fluoreszenzintensitäten vor der EF-Anwendung an (vertikale Linie stellt ± SEM dar). Die gemessenen Axone verliefen senkrecht zur Richtung von EF (90,6° ± 1,6°, Mittelwert ± Standardabweichung, n = 12 aus 4 Experimenten).

Wenn das gerichtet bewegte Ca2+ Integrin asymmetrisch reguliert, würde dies zu einer asymmetrischen Reorganisation des Zytoskeletts, einschließlich Aktinfilamenten und Mikrotubuli, führen. In der vorliegenden Studie ragten RGC-Axone in Gegenwart von Cytochalasin D, einem Inhibitor der Aktinpolymerisation, nicht aus dem Netzhautstreifen heraus (zwei getestete Netzhäute, ergänzende Abbildung 9). Allerdings können Axone ohne Filopodien, die mit Cytochalasin D kultiviert wurden, ein galvanotropes Orientierungsverhalten zeigen, obwohl sie langsamer wachsen29. Dies ließ die Möglichkeit aufkommen, dass die elektrische Axonsteuerung zumindest teilweise von der Dynamik der Mikrotubuli abhängt.

Mikrotubuli nehmen in einem wachsenden Axon zwei Zustände an: dynamisch instabile Mikrotubuli und stabile Mikrotubuli30,31,32. Stabile Mikrotubuli verwandeln sich bei der Phosphorylierung von MAP1B durch GSK3β30 in instabile Mikrotubuli. Da gezeigt wurde, dass GSK3β und MAP1B eine funktionelle Rolle bei der Steuerung des Wachstumskegels spielen33,34, wurde ein Inhibitor von GSK3β, LY2090314, getestet. LY2090314 bei 2,5 nM verstärkte die ventrale Ausdehnung ohne EF [Abb. 5a, i, vgl. Abbildung 1k (nein), zweiseitiger t-Test, P < 0,001]. Bei EF wurde kein weiterer Anstieg beobachtet (Abb. 5b, i). LY2090314 erhöhte bei 10 nM immer noch die Basalverlängerung [Abb. 5c, i, vgl. Abbildung 1k (nein), zweiseitiger t-Test, P < 0,001] ohne Auswirkung von EF (Abb. 5d, i). Allerdings verringerte LY2090314 bei 50 nM die Basalverlängerung [Abb. 5e, i, vgl. Abbildung 1k (nein), zweiseitiger t-Test, P < 0,001] ohne Auswirkung von EF (Abb. 5f, i). Die Verstärkung und Unterdrückung der ventralen Ausdehnung ohne EF könnte durch zwei Rollen der Mikrotubuli bei der Axonverlängerung erklärt werden. Dynamische Mikrotubuli interagieren mit F-Aktin an der Vorderkante, um das Vorrücken des Wachstumskegels zu fördern31. Die hohe Dosis von LY2090314 hätte zu einem Mangel an dynamischen Mikrotubuli geführt. Andererseits hätte die niedrige Dosis von LY2090314 die Stabilisierung wachsender Mikrotubuli hochreguliert und die dynamischen Mikrotubuli für das Fortschreiten der Wachstumskegel erhalten. Wachsende Mikrotubuli bestehen aus dynamisch instabilen Mikrotubuli, die sich vom positiven Ende eines stabilen Mikrotubulus aus erstrecken32. Dephosphoryliertes MAP1B bindet an diese wachsenden Mikrotubuli, um sie zu stabilisieren31, wodurch der Axonschaft verlängert wird. Als nächstes wurde SC79, ein Aktivator von Akt, getestet, da Akt (PKB) GSK3β35 hemmt und stromabwärts der Integrinaktivierung durch die Aktivierung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)18,36 aktiviert wird, wobei die Hemmung die ventrale Ausdehnung ohne EF verstärkte EF-Effekte abgeschafft (Ergänzende Abbildung 10). SC79 bei 25 μM verstärkte auch die ventrale Ausdehnung ohne EF [Abb. 5g, ich vgl. Abbildung 1k (nein), zweiseitiger t-Test, P < 0,001]. Der EF erhöhte die ventrale Ausdehnung nicht weiter (Abb. 5h, i). Abbildung 5j fasst das Fehlen von EF-Effekten in Gegenwart von LY2090314 und SC79 zusammen. Der Verlust elektrischer Effekte könnte darauf hindeuten, dass die Hemmung von GSK3β für die elektrische Axonsteuerung wesentlich ist.

a RGC-Axone, kultiviert mit 2,5 nM LY2090314. b RGC-Axone, kultiviert mit 2,5 nM LY2090314 im ventral gerichteten EF. c RGC-Axone, kultiviert mit 10 nM LY2090314. d RGC-Axone, kultiviert mit 10 nM LY2090314 im ventral gerichteten EF. e RGC-Axone, kultiviert mit 50 nM LY2090314. f RGC-Axone, kultiviert mit 50 nM LY2090314 im ventral gerichteten EF. g RGC-Axone, kultiviert mit 25 μM SC79. h RGC-Axone, kultiviert mit 25 μM SC79 im ventral gerichteten EF. i VERs (Mittelwert ± Standardabweichung) von Netzhautstreifen, die mit 2,5 nM, 10 nM und 50 nM LY2090314 und 25 μM SC79 ohne EF (nein) und mit ventral gerichtetem EF (EF) kultiviert wurden. Jede Spalte stellt den Wert dar, der aus 18 Fotos stammt, die mit unterschiedlichen Fokusstufen von 3 Netzhautstreifen aufgenommen wurden. Horizontale Balken und Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (zweiseitiger t-Test, **P < 0,001). j EFIs (Mittelwert ± Standardabweichung) ohne Medikament (Forts.) und mit LY2090314 und SC79. Die Kontrolle wurde aus der ergänzenden Abbildung 1e (Forts.) erneut aufgetragen. k, l, n, o RGC-Axone, die sich im dorsal gerichteten EF nach dorsal drehen. Sie erstreckten sich vom ventralen Rand der Netzhautstreifen. Der EF wurde vor der Fluoreszenzfärbung 3 Stunden lang angewendet. k Ein Transmissionsbild eines RGC-Axons. l Ein Fluoreszenzbild des Axons in (k), gefärbt mit TubulinTrackerTM Green. m Querprofile des Fluoreszenzbildes in (l) am Wendepunkt (links, schwarz) und dem geraden Teil (rechts, blau). Einfügungen zeigen jede Scanlinie in Gelb mit dem Asymmetrieindex (AI, siehe ergänzende Abbildung 11a, b). Eine Pixelgröße: 14,4 × 14,4 nm. n Ein Transmissionsbild eines RGC-Axons. o Ein Fluoreszenzbild des Axons in (n), gefärbt mit Acti-stainTM 488 fluoreszierendem Phalloidin.

Unter der Annahme, dass die Integrinaktivierung durch Akt-Aktivierung zur GSK3β-Hemmung führt, um Mikrotubuli zu stabilisieren, würde asymmetrisch aktiviertes Integrin Mikrotubuli asymmetrisch stabilisieren. Daher wurde die Verteilung der Mikrotubuli in den der Kathode zugewandten Axonen durch Anfärben mit TubulinTrackerTM Green untersucht (Abb. 5k, l). Der Asymmetrieindex (AI, 1,00 bedeutet Symmetrie) wurde aus dem Fluoreszenzbild erhalten (Abb. 5m, ergänzende Abb. 11a, b). Die KI deutete darauf hin, dass sich die Mikrotubuli am Wendepunkt asymmetrisch eher auf der inneren (dh kathodischen) Seite befanden; Der Mittelwert der AIs betrug 2,02 ± 0,17 (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6 Axone aus fünf unabhängigen Experimenten, zweiseitiger t-Test, P <0, 01, ergänzende Abbildung 11a, c – g). Diese inneren Mikrotubuli waren stabil, da sie nach 30-minütiger Nocodazol-Behandlung existierten, in der dynamische Mikrotubuli verschwanden (ergänzende Abbildung 11g). F-Aktin zeigte keine derart einseitige Verteilung (Abb. 5n, o).

Integrin und sein ECM-Ligand sind für die korrekte Führung von RGC-Axonen in vivo12 unerlässlich. Es bleibt jedoch unbekannt, wie die Integrin-Ligand-Wechselwirkung das Axon in Richtung der zukünftigen Papille steuert. Integrinbasierte Adhäsionen unterstützen die Beweglichkeit der Wachstumskegel37. Integrinvermittelte Punktkontakte sind eher seitlich asymmetrisch verteilt und erstrecken sich in einem sich drehenden Wachstumskegel38,39. Integrinvermittelte Adhäsionen liegen den Vorsprüngen von Wachstumskegeln zugrunde und sind ein attraktiver Hinweis40. Axonwachstumsraten korrelieren mit der Bildung von Integrin-basierten Adhäsionen als Reaktion auf positive und negative Signale41,42. Somit ist Integrin ein entscheidender Akteur bei der Regulierung des Axonwachstums und der Axonsteuerung.

Die Ergebnisse der Ca2+-Fluoreszenzmessungen legen nahe, dass die anodische Oberfläche eines Axons um mindestens 10 % häufiger auf EF-bewegtes Ca2+ trifft als die kathodische Oberfläche. Da das Integrin-Kopfstück, das ADMIDAS enthält, ~1 zL (10−21 L)43 einnimmt und die Dichte von Ca2+ ~0,6/zL in 1 mM Ca2+ beträgt, würde das gerichtet bewegte Ca2+ asymmetrisch an ADMIDAS binden. Da die Ca2+-Bindung an ADMIDAS die Integrin-Ligand-Bindung hemmt11, würde eine asymmetrische Ca2+-Bindung zu einer geringeren Hemmung des Integrins auf der Kathodenseite führen. Das ligandengebundene Integrin bildet Cluster, um intrazelluläre Signale für die Integrin-Zytoskelett-Verbindung zu senden36,44. Die Clusterbildung könnte durch einen positiven Rückkopplungsmechanismus45 erleichtert werden, der den elektrischen Effekt verstärken könnte.

Das asymmetrisch aktivierte Integrin würde den PI3K-Akt-Weg asymmetrisch aktivieren. Es wurde gezeigt, dass die asymmetrische PI(3,4,5)P3- und Akt-Signalübertragung als früher Regulator bei der attraktiven Drehung eines Wachstumskegels dient46. Da Akt (PKB) GSK3β35 hemmt, würde das weniger gehemmte Integrin GSK3β auf der Kathodenseite stärker hemmen. Da GSK3β stabile Mikrotubuli verringert, um dynamische Mikrotubuli durch MAP1B-Phosphorylierung30 aufrechtzuerhalten, würde eine stärkere Hemmung von GSK3β die stabilen Mikrotubuli auf der Kathodenseite erhöhen. Somit würde eine geringere Hemmung des Integrins zu einer stärkeren Stabilisierung der Mikrotubuli führen. In einem sich drehenden Axon werden Mikrotubuli seitlich stabilisiert, um sich im Wachstumskegel und im Wachstumsschaft zu drehen30,47. Die asymmetrische Stabilisierung der Mikrotubuli würde das Axon zur Kathode lenken (ergänzende Abbildung 12). Die Mikrotubuli-Fluoreszenz zeigte, dass die Spitzenfluoreszenz bei der halben Fluoreszenzintensität kathodisch verschoben war (Abb. 5m und ergänzende Abb. 11). Die rote vertikale Linie in der ergänzenden Abbildung 11 zeigt die Mitte des halben Fluoreszenzniveaus an, nicht das genaue Axonzentrum. Da jedoch die Länge des halben Fluoreszenzniveaus ~100 Pixel beträgt und die Größe eines Pixels 14,4 nm beträgt, deckt das halbe Fluoreszenzniveau fast den Durchmesser eines Axons ab. An einem Wendepunkt wurde eine asymmetrische Fluoreszenzverteilung gefunden (ergänzende Abbildung 11a), die an geraden Teilen nicht gefunden wurde (ergänzende Abbildung 11b). Daher ist es wahrscheinlich, dass Mikrotubuli an einem Wendepunkt eines Axons als Reaktion auf einen EF asymmetrisch verteilt sind. Andere Substrate für GSK3β, APC und CRMP2 fördern das Einfangen und Zusammensetzen von Mikrotubuli durch die Hemmung von GSK3β48. APC und CRMP2 könnten auch zur kathodischen Steuerung bei asymmetrischer GSK3β-Hemmung beitragen. GSK3β fungiert auch als Schlüsselregulator bei der EF-induzierten gerichteten Migration neuronaler Vorläuferzellen49 und Mikroglia50.

Der Unterschied in den Dosis-Wirkungs-Beziehungen zwischen TASC und W1B10 (Abb. 1l) kann auf ihre Epitope zurückzuführen sein; TASC bindet an die Region in der Nähe der Transmembrandomäne51, während W1B10 vermutlich an die Ligandenbindungsdomäne bindet52. Es könnte postuliert werden, dass TASC die Clusterbildung bei der Expression seines Epitops in der ligandengebundenen offenen Konformation erleichtert, was die Adhäsion an Laminin fördern könnte25. Andererseits könnte W1B10 die Dissoziation des Integrins vom Liganden erleichtert haben26. Die Dissoziation kann für die Axonverlängerung notwendig sein und diese fördern, da ein hoher Mn2+-Gehalt die Axonverlängerung unterdrückte (ergänzende Abbildung 2) und weil Mn2+ die Verstärkung der Axonverlängerung durch W1B10 aufhob (Abb. 2g). Die Dissoziation und Inaktivierung von Integrin würde die dynamischen Mikrotubuli für das Fortschreiten der Wachstumskegel aufrechterhalten. Diese Idee könnte durch die Tatsache gestützt werden, dass die Hemmung von PI3K die basale Ausdehnung von RGC-Axonen verstärkte (ergänzende Abbildung 10). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Axon auf zwei Arten verlängert wird: (1) Verlängerung des Axonschafts durch stabile Mikrotubuli und (2) Vorschub des Wachstumskegels durch dynamische Mikrotubuli. TASC hätte den ersteren Prozess durch die Erhöhung stabiler Mikrotubuli durch GSK3β-Hemmung verstärkt, während W1B10 den letzteren Prozess durch die Bereitstellung dynamischer Mikrotubuli gefördert hätte.

Das Zentralnervensystem (ZNS), einschließlich der Netzhaut, entwickelt sich mit der Proliferation von Neuroepithelzellen, wobei die erstgeborenen Neuronen über große Entfernungen wandernde Axone wie Kommissuraxone und Sehnerven ausdehnen53,54. Die Mechanismen für die korrekte Ausrichtung dieser langen, ersten Axone sind unbekannt. Die bipolar geformten Neuroepithelzellen erzeugen durch ihren apikobasalen Natriumtransport positive Potenziale im extrazellulären Raum im Basalbereich des Neuroepithels4,7,8. Da sich diese Zellen am aktivsten vermehren und die Zelldichte im dorsalen Teil des Neuralrohrs zunimmt55, wird das positivste Potenzial wahrscheinlich im dorsalen Teil des Neuroepithels aufgebaut4. Tatsächlich wird das höchste Potenzial im dorsalen Teil des retinalen Neuroepithels gemessen7, wo sich die Zellen am aktivsten vermehren56. Andererseits sind die Zellen im ventralen Teil des Augenbechers dreieckig geformt3, ähnlich der keilförmigen Bodenplattenzelle im Neuralrohr57. Diese Morphologie impliziert, dass diese ventralen Zellen nicht am apikobasalen Natriumtransport beteiligt sind. Die Ionenkanäle der Bodenplattenzelle sind nicht für den Natriumtransport verantwortlich58. Daher wird das positive Potenzial nicht im ventralen Teil des sich entwickelnden ZNS, einschließlich der Netzhaut, erzeugt7. Daher ist der resultierende EF in dorsoventraler Richtung ausgerichtet. Dieser EF würde die ersten Axone steuern, wie in der Netzhaut7 gezeigt. Die Orientierungshilfen für kommissurale Axone sind immer noch rätselhaft; Eine Frage (-?-) wird in Extended Data Abb. 4h von Dominici et al.2 aufgeworfen, wobei „+“ für Netrin steht, „–“ für ein mutmaßliches Abwehrmolekül im Rückenbereich59,60,61,62. Der dorsoventrale EF kann auch kommissurale Axone zur Bodenplatte leiten. Da Neuroepithelzellen während der Neurogenese EFs erzeugen, kann Galvanotropismus hauptsächlich bei der ZNS-Entwicklung eingesetzt werden.

Befruchtete Eier wurden von einem örtlichen Bauern gekauft (Asian Rural Institute, Nasushiobara, Japan). Das Studienprotokoll wurde von der Tierethikkommission der International University of Health and Welfare genehmigt. Eine neurale Netzhaut, die aus einem sechs Tage lang inkubierten Hühnerembryo isoliert wurde (Embryonaltag 6, E6), wurde mit der Innenseite nach oben auf einen schwarzen Membranfilter (13006-025N, Sartorius) ausgebreitet. Die Retina-Membran-Anordnung wurde in nasotemporaler Richtung am Segment 0,7 mm dorsal des Sehnervenkopfes in einen Streifen geschnitten (Abb. 1a). Die Größe des Netzhautstreifens betrug 0,8 mm Breite und 2,4–2,7 mm Länge (Abb. 1b). Um die ursprüngliche Richtung des Netzhautstreifens zu ermitteln, wurde das Schläfenende senkrecht zu den dorsalen und ventralen Kanten geschnitten, und das Nasenende wurde schräg dazu geschnitten, wobei die ventrale Kante länger war. Zur Fixierung des Netzhautstreifens wurde ein keilförmiger Membranfilter zwischen Nasenrand und Trogwand der Kulturkammer platziert (Abb. 1b). Es war unbedingt erforderlich, dass der Netzhautstreifen vollständig flach aufliegt. Wenn sich der Netzhautstreifen während der Inkubation an der Peripherie vom Membranfilter löste, störte die Netzhautfaltung die Richtung der herauswachsenden Axone. Das Schrumpfen oder Zurückziehen des Netzhautstreifens vom Rand des Membranfilters führte zu einer nicht geraden Linie am ventralen Rand des Netzhautstreifens. Diese Netzhäute wurden aus den Daten ausgeschlossen. Das Vorstehen von Zellmasse aus der Oberfläche des Netzhautstreifens verursachte vielfältige, unregelmäßige, lange Verlängerungen der Axone. Diese Netzhäute wurden ebenfalls ausgeschlossen. Das vollständige Protokoll für die Netzhautstreifenkultur lautet wie folgt63.

DMEM (041-29775, niedriger Glucosegehalt mit L-Glutamin und Phenolrot, FUJIFILM Wako, Osaka, Japan) wurde zu 3,6 ml einer Serummischung [25 ml FBS (Biosera) und 5 ml Hühnerserum (Gibco®)] hinzugefügt, gelagert bei 4 °C] in einem konischen 50-ml-Röhrchen, so dass das Gesamtvolumen 30 ml betrug (endgültige Serumkonzentrationen: FBS 10 %, Hühnerserum 2 %). Die Serummischung wurde in Eis gegeben. Das konische Röhrchen wurde in einen Trockeninkubator bei 38 °C gestellt. Beide Wände der Wanne (22,0 mm lang, 3,2 mm breit und 2,0 mm tief) der Kulturkammer (Φ25, 2 mm dick, hergestellt aus einer Acrylscheibe) wurden mit Silikonfett (Dow Corning, HVG) beschichtet ) mithilfe eines feinen Stabes (einem hölzernen Zahnstocher), der vor der Verwendung mit Kimwipes® und Ethanol gereinigt wurde. Ohne die Beschichtung haftete Matrigel® (356234, Corning®) an der Trogwand. Ein Deckglas (Φ25) wurde mit Silikonfett fest an beiden Seiten der Kulturkammer befestigt, um den Boden des Trogs zu bilden. Eine kleine Menge Silikonfett wurde auf die Oberseite der Kulturkammer entlang beider Wände des Trogs aufgetragen, um anschließend ein weiteres Deckglas (Φ15) sicher zu befestigen.

Ein Aliquot Matrigel® (152 μl, gelagert bei –20 °C) wurde in einen Kühlschrank bei 4 °C gestellt. Das Aliquot von Matrigel® wurde nach 30 Minuten in Eis gegeben. Dem Matrigel® wurde eine Serummischung von 48 μL zugesetzt (endgültige Serumkonzentrationen: FBS 20 %, Hühnerserum 4 %). Wenn ein Medikament angewendet wurde, wurde das Medikament dem Matrigel® zugesetzt. Die Matrigel® enthaltenden Seren (und das Arzneimittel) wurden in Eis gekühlt und durch Klopfen homogenisiert. Das Abkühlen und Klopfen wurde mindestens dreimal wiederholt. Das Matrigel® und ein Aluminiumblock (Φ25, 15 mm dick) wurden in Eis gelegt. Eine 35-mm-Schale wurde auf Eis gestellt und mit DMEM gefüllt, um eine 10-μL-Pipettenspitze durch Ansaugen des eisgekühlten DMEM vor dem Ansaugen von Matrigel® zu kühlen.

Sechs Tage lang bebrütete Eier wurden in einen Reinraum gebracht. Das Ei wurde mit der Luftkammer nach oben auf einen Eierständer gestellt. Die Schale wurde zerbrochen und der Embryo in einer Petrischale freigelegt. Der Hals wurde mit einer Pinzette durchtrennt und der Kopf geschöpft und in eine 35-mm-Schale überführt, die mit einer ausgewogenen Hanks-Salzlösung (HBSS), modifiziert ohne Ca2+, Mg2+ (H6648, Sigma-Aldrich), unter Verwendung eines Rings (Φ6-7) gefüllt war ) aus rostfreiem Draht, der durch Verdrehen eines dünnen rostfreien Drahtes hergestellt und mit einem Halter verbunden wurde. Für die Inszenierung wurden mehrere Köpfe verglichen. Ein Auge wurde unter einem Präpariermikroskop entkernt und in eine andere mit HBSS gefüllte 35-mm-Schale überführt, indem die Linse mit einer feinen Pinzette festgehalten wurde. Extraokulare Muskeln wurden mit einer feinen Pinzette entfernt. Entlang des Äquators wurde in der Nähe der Sehspalte ein kleiner Schnitt gemacht. Das Auge wurde in eine andere mit HBSS gefüllte 35-mm-Schale überführt, die einen schwarzen Membranfilter (13006-025N, Sartorius) enthielt. Das Pigmentepithel wurde mit einer feinen Pinzette abgezogen, indem die Pinzettenspitze in den Spalt zwischen der neuralen Netzhaut und dem Pigmentepithel eingeführt wurde, um sie zu trennen. Der Sehnervenkopf wurde mit einer feinen Pinzette durchtrennt. Der Sehnerv und das Pigmentepithel wurden entfernt. Entlang des Äquators wurde ein kontinuierlicher Schnitt vorgenommen, um die vordere Netzhaut von der hinteren Netzhaut zu trennen. Das Auge wurde mit der Linse nach oben auf den schwarzen Membranfilter gesetzt. Das Auge wurde vorsichtig auf den Membranfilter gedrückt, so dass die äußere Grenzmembran der hinteren Netzhaut am Membranfilter befestigt war. Der Glaskörper wurde von der hinteren Netzhaut getrennt. Die hintere Netzhaut wurde am Membranfilter befestigt, indem die Peripherie auf den Membranfilter gedrückt wurde. Der Glaskörper konnte an den dorsalen, nasalen und temporalen Teilen von der Netzhaut getrennt werden. Anschließend wurde der Glaskörper von der Sehspalte abgetrennt. Der gesamte Glaskörper und die vordere Netzhaut wurden zusammen mit der Linse entfernt. Die gesamte hintere Netzhaut wurde am Membranfilter befestigt, indem mit einer feinen Pinzette auf die Peripherie des Membranfilters gedrückt wurde (Abb. 1a).

Die Retina-Membran-Anordnung wurde vom HBSS abgehoben und mit der Retina-Seite nach oben auf ein Filterpapier (Whatman®, Φ55, 1001-055) gelegt. Das Filterpapier wurde unter das Präpariermikroskop gelegt, um den Sehspalt vertikal zu positionieren. Eine 15-mm-Edelstahlskala mit einer Mindestskalierung von 0,5 mm wurde in der Nähe der Netzhaut links parallel zum Sehspalt angebracht. Die Höhe des Sehnervenkopfes wurde anhand der Skala bestimmt. Mit einem Stück Rasierklinge (0,1 mm dick, 8 mm breit), das an einem Klingenhalter befestigt war, wurde ein horizontaler Schnitt auf Höhe des Sehnervenkopfes in nasotemporaler Richtung (dh senkrecht zur Sehspalte) vorgenommen. Durch diesen Schnitt wurde auf der Skala die Höhe des Sehnervenkopfes definiert. Parallel dazu wurde ein horizontaler Schnitt 0,7 mm dorsal zum vorherigen Schnitt vorgenommen. Dieser Schnitt bildete den ventralen Rand des Netzhautstreifens. Ein weiterer horizontaler Schnitt wurde 0,8 mm dorsal zum vorherigen Schnitt parallel dazu vorgenommen. Durch diesen Schnitt wurde der dorsale Rand des Netzhautstreifens definiert und die Breite des Netzhautstreifens definiert. Es wurde ein vertikaler Schnitt 1,2 mm links von der Optikusfissur vorgenommen. Es wurde ein schräger Schnitt von 1,2–1,5 mm bis zur Optikusfissur vorgenommen, wobei die ventrale Kante länger war. Dieser schräge Schnitt definierte die Richtung des Netzhautstreifens (Abb. 1b). Ein Stück Parafilm wurde am Boden einer 35-mm-Schale befestigt. Auf den Parafilm wurde ein Tropfen DMEM (25 μl) aufgetragen. Wenn ein Medikament angewendet wurde, wurde das Medikament zur Vorinkubation dem DMEM zugesetzt. Der Netzhautstreifen wurde in den DMEM-Tropfen übertragen, indem die untere rechte Ecke des Netzhautstreifens mit einer feinen Pinzette festgehalten wurde.

Der eisgekühlte Aluminiumblock wurde in eine Petrischale gelegt. Der Raum um den Aluminiumblock war mit Eis gefüllt. Die Kulturkammer wurde auf den Aluminiumblock gestellt. Ein Mikroliter des eisgekühlten Matrigel® enthaltenden Serums wurde auf den Boden der Mulde der Kulturkammer getropft. Der Boden der Wanne wurde mit einem feinen Wolframstab abgewischt, der elektrolytisch poliert wurde, sodass der Boden mit dem Matrigel® beschichtet war. Auf den Boden des Trogs wurde ein Membranfilterkeil gelegt. Dieser Keil wurde zur Fixierung des Netzhautstreifens verwendet (Abb. 1b). Die Netzhaut-Membran-Anordnung wurde mit der Netzhaut nach oben auf den Boden der Wanne gelegt. Der Netzhautstreifen wurde mit dem feinen Wolframstab senkrecht zur Wand der Mulde positioniert. Die Retina-Membran-Anordnung wurde an der Unterseite befestigt, indem der Raum zwischen der Retina-Membran-Anordnung und der Unterseite verringert wurde, um ein Aufschwimmen zu verhindern. Der Schläfenrand des Netzhautstreifens wurde auf beiden Seiten der Mulde in deren Mitte an der Wand befestigt. Der Netzhautstreifen wurde durch den Keil des Membranfilters in der Mulde fixiert (Abb. 1b). Zehn Mikroliter des eisgekühlten Matrigel®-haltigen Serums wurden abgesaugt und 8 μl über den Netzhautstreifen getropft, wobei 2 μl in der 10-μl-Pipettenspitze belassen wurden, um keine Luftblasen hinzuzufügen. Wenn im Matrigel® Luftblasen zu sehen waren, wurden diese mit dem feinen Wolframstab entfernt. Ein Deckglas (Φ15) wurde über den Netzhautstreifen gelegt und mit Silikonfett sicher an der Oberseite der Kulturkammer befestigt. Die Kulturkammer wurde zum Gelieren in eine befeuchtete Thermostatkammer bei 37 °C gestellt. Das Gelieren könnte auch vor dem Eintropfen von 8 μl Matrigel® erfolgen, um ein Ablösen des Netzhautstreifens vom Membranfilter zu verhindern. Nach fünfminütigem Gelieren wurde die Kulturkammer auf ein gelbes Papier (Φ25) gelegt, das auf eine Acrylscheibe (Φ30, 10 mm dick) gelegt wurde, um die Kulturkammer nach der Inkubation leicht von der Acrylscheibe zu trennen. Für die Trennung wurden die gelben Papiere zwischen schwarzen Membranfiltern verwendet, die in einer Plastikhülle aufbewahrt wurden. Das konische 50-ml-Röhrchen mit DMEM mit 10 % FBS und 2 % Hühnerserum wurde aus dem Trockeninkubator entnommen. Der Trog der Kulturkammer wurde mit einer feuerpolierten Pasteurpipette aus Glas mit DMEM (ca. 100 μl) gefüllt. Das DMEM wurde vorsichtig von beiden Enden der Wanne eingespritzt, um Luftblasen zu vermeiden. Die Acrylscheibe mit der Kulturkammer wurde in eine Eckvertiefung einer Kulturplatte mit 6 Vertiefungen gelegt. Die beiden benachbarten Vertiefungen wurden mit einem Überschussvolumen (14 ml) DMEM mit 10 % FBS und 2 % Hühnerserum gefüllt, um Veränderungen in der Zusammensetzung des Mediums um die Zelle aufgrund der Elektrophorese zu verhindern. Die beiden Enden des Trogs wurden mithilfe eines Paars U-förmiger Glasröhrchen (Φ3), die vollständig mit dem Kulturmedium gefüllt waren, mit den benachbarten, mit DMEM gefüllten Vertiefungen verbunden, um Luftblasen zu vermeiden. Die beiden mit dem Kulturmedium gefüllten Vertiefungen wurden über ein weiteres Paar U-förmiger Glasröhrchen (Φ3), gefüllt mit 1 % Agar-Kochsalzlösung, mit den benachbarten beiden Vertiefungen verbunden, die mit DMEM, gepuffert mit 25 mM HEPES (048-30275), gefüllt waren , hoher Glukosegehalt mit L-Glutamin und Phenolrot, FUJIFILM Wako). Somit wurden fünf Brunnen für eine Strömungsförderung genutzt. Der verbleibende Brunnen wurde mit destilliertem Wasser gefüllt, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Destilliertes Wasser (1 ml) wurde in die Vertiefung eingespritzt, die die Kulturkammer um die Acrylscheibe herum enthielt. Die Kulturplatte mit 6 Vertiefungen wurde in ein luftdichtes Gefäß (2,5 l Volumen) gegeben. Eine Packung AnaeroPack®·CO2 (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc., Tokio) wurde in das luftdichte Gefäß gegeben. AnaeroPack®·CO2 produziert CO2 und hält 5 % CO2 in einem luftdichten Gefäß für mindestens 150 Stunden. Der Deckel des luftdichten Gefäßes war geschlossen. Das luftdichte Gefäß wurde in einen Trockeninkubator bei 38 °C gestellt und 24 Stunden lang inkubiert.

Das Kultursystem zur Bereitstellung eines konstanten EF enthielt die Anoden- und Kathodenelektroden für die Stromversorgung und ein Paar Glasmikropipettenelektroden zur Aufzeichnung der Spannungen im Kulturmedium. Die dem Kulturmedium zugeführte Strommenge wurde durch eine negative Rückkopplungsschaltung reguliert, um die Spannungsdifferenz zwischen den beiden Punkten (15 mm Abstand) entlang des Stromflusses auf dem gewünschten Wert (225 mV für 15 mV/mm) zu halten. Das vollständige Protokoll für die konstante EF-Kultur lautet wie folgt64.

Die Anoden- und Kathoden-Ag/AgCl-Scheibenelektroden (Φ15–25) wurden in die beiden mit HEPES-gepuffertem DMEM gefüllten Vertiefungen platziert. Die Elektroden zur Überwachung der Spannungen im Kulturmedium wurden aus einem Φ3-Glasrohr hergestellt, indem es über einem kleinen Feuer erhitzt und daran gezogen wurde, bis der Spitzendurchmesser 0,3 mm betrug. Die Spitze und die Schnittkante der Glaspipette wurden feuerpoliert. Die Glaspipettenelektroden wurden mithilfe eines Silikonschlauchs (Innendurchmesser 2,5) und einer 2,5-ml-Spritze mit 1 % Agar-Kochsalzlösung gefüllt. Ein kleines Ag/AgCl-Pellet (Φ1), das einen Ag/AgCl-Draht enthielt, wurde in die Glaspipettenelektroden eingeführt. Der Ag/AgCl-Draht wurde an einen Kupferanschlussdraht angelötet. Diese Verbindung wurde mit Epoxidharz bedeckt, um einen Kontakt mit dem Agarsalzgel zu verhindern. Das Anschlusskabel wurde an den Eingang eines Spannungsfolgers angeschlossen. Als Spannungsfolger wurde ein Operationsverstärker LMC662CN (Texas Instruments) verwendet, da der Eingangswiderstand mehr als 1 TeraΩ und der Vorspannungsstrom 2 fA betrug. Um die Länge des mit der Überwachungselektrode und dem Spannungsfolger verbundenen Anschlusskabels zu minimieren, wurde der LMC662CN in der Nähe der Kulturkammer im luftdichten Gefäß platziert. Die Kabel zu den Anoden- und Kathodenelektroden, die Ausgänge der beiden Spannungsfolger und die Stromversorgung des LMC662CN wurden mit den Anschlüssen verbunden, die mit Silikonfett an der Wand des luftdichten Gefäßes befestigt waren. Die Monitorelektroden wurden unmittelbar vor der Vorbereitung des Netzhautstreifens vorbereitet. Die Monitorelektroden wurden nach jedem Gebrauch in kochendem Wasser gereinigt.

Die beiden Überwachungselektroden wurden an beiden Rändern des oberen Deckglases (Φ15) in das Kulturmedium in der Wanne eingeführt, um den Abstand zwischen den beiden Überwachungselektroden bei 15 mm zu halten. Ein Elektrodenhalter wurde aus einer Acrylbox mit zwei Löchern (Φ3,2) hergestellt. Die Spannungsdifferenz zwischen den beiden Punkten wurde kontinuierlich mit einem Differenzverstärker überwacht. Der Ausgang des Differenzverstärkers wurde mit dem invertierenden Eingang (–) eines Operationsverstärkers (BB3582J, Burr-Brown) verbunden. BB3582J wurde aufgrund seines großen Betriebsspannungsbereichs (±115 V) verwendet. Eine Referenzspannung (Vref) wurde verwendet, um die Spannungsdifferenz zwischen den beiden Punkten durch die Gegenkopplungsschaltung zu regulieren. Vref wurde mit dem nichtinvertierenden Eingang (+) von BB3582J verbunden. Der Rückkopplungsstrom floss durch das Kulturmedium zwischen den beiden Monitorelektroden, den Gesamtwiderständen der Anoden- und Kathodenelektroden, den Agar-Salz-Brücken, den Glasröhrchen mit dem Kulturmedium und den daran angeschlossenen Lösungen sowie dem Rückkopplungswiderstand ( Rf). Rf wurde mithilfe eines variablen Widerstands (0,1–1,0 MΩ) eingestellt. Der Ausgang des Differenzverstärkers war aufgrund der negativen Rückkopplung durch den Operationsverstärker gleich Vref. Die Offset-Spannung des Differenzverstärkers, einschließlich der Offsets der beiden Überwachungselektroden und der beiden Spannungsfolger, wurde durch Subtrahieren der während Strom-Aus-Perioden von 0,5 s in einem Intervall von 100 s aufgezeichneten Ausgangsspannung aufgehoben (Arbeitszyklus 99,5 %). . Der Stromfluss wurde mit einem impulsgesteuerten Relaisschalter unterbrochen. Die Ausgabe des Differenzverstärkers wurde während der gesamten Inkubationszeit kontinuierlich mit einem Diagrammschreiber (PowerLab 2/26, ADInstruments) aufgezeichnet, um zu überprüfen, ob alle Komponenten ordnungsgemäß funktionierten. Da die Stromamplitude zur Aufrechterhaltung einer EF-Stärke von 15 mV/mm etwa 180 μA (150–200 μA) betrug, wurde der spezifische Widerstand des Kulturmediums auf ~53 Ωcm geschätzt.

Zur Herstellung des Netzhautstreifens wurde eine ausgewogene Salzlösung nach Hanks (HBSS), modifiziert ohne Ca2+, Mg2+ (H6648, Sigma-Aldrich), verwendet. Ein Netzhautstreifen wurde in 8 μl Matrigel® (356234, Corning®) eingebettet, das 20 % FBS (Biosera) und 4 % Hühnerserum (Gibco®) enthielt. Der Trog der Kulturkammer (100 μl Volumen) wurde mit DMEM (041-29775, niedriger Glucosegehalt mit L-Glutamin und Phenolrot, FUJIFILM Wako, Osaka, Japan) gefüllt, das 10 % FBS und 2 % Hühnerserum enthielt. Beide Enden des Trogs wurden mit den benachbarten Vertiefungen verbunden, die mit demselben Kulturmedium mit Überschussvolumen (14 ml) gefüllt waren, indem ein Paar mit Kulturmedium gefüllter Glasröhrchen verwendet wurde. Dem Kulturmedium wurde eine Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-Suspension (161-23181, FUJIFILM Wako) in einer Konzentration von 1 % zugesetzt. Die Anoden- und Kathodenelektroden wurden in die anderen Vertiefungen gelegt, die mit DMEM, gepuffert mit 25 mM HEPES (048-30275, hoher Glucosegehalt mit L-Glutamin und Phenolrot, FUJIFILM Wako), gefüllt waren.

Lebende Zellen und Axone wurden mit Calcein-AM (10 μM, DOJINDO) in DMEM (044-32955, hoher Glucosegehalt mit L-Glutamin, HEPES-gepuffert, ohne Phenolrot, FUJIFILM Wako) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt. Für die Fluoreszenzbildgebung wurden ein konfokaler Scanner vom Nipkow-Typ (CSU10, Yokogawa, Kanazawa, Japan), eine sCMOS-Kamera (ORCA®-Flash4.0 V2, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) und HSR-Software (Hamamatsu) verwendet. Die ventrale Ausdehnungsrate (VER) wurde durch das Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensität zwischen den Linien 150 μm und 400 μm ventral des Netzhautstreifens entlang der gesamten ventralen Kante gegenüber der Hintergrundintensität ermittelt, die im Bereich ohne Netzhaut gemessen wurde (Abb. 1c, D). Fotos für die VER-Messung wurden mit einem ×4-Objektiv auf der Ebene der RGC-Schicht aufgenommen, was repräsentative Bilder lieferte. ImageJ wurde verwendet, um mittlere Fluoreszenzintensitäten in einem Bereich von 0–255 zu messen. Die Hintergrundintensität wurde mithilfe von Photoshop® Elements auf etwa 21 angepasst.

TASC (MAB19294) und W1B10 (I8638) wurden von Millipore bzw. Sigma gekauft. Ein monoklonaler Maus-IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper M075-3M2 (Functional Grade) wurde von MBL (Nagoya, Japan) erworben. TASC wurde in einer Menge von 20, 50, 100, 200 μg/ml angewendet. W1B10 wurde in einer Menge von 10, 20, 50, 100, 200 μg/ml angewendet. M075-3M2 wurde in einer Menge von 100–200 μg/ml angewendet. Netzhautstreifen wurden 10 Minuten lang in einem Tropfen DMEM (25 μl), der den Antikörper enthielt, auf Parafilm® vorinkubiert. Da die Antikörper in Phosphatpuffer präsentiert wurden, wurden durch den Phosphatpuffer bedingte Abnahmen an freiem Ca2+ und Mg2+ durch Zugabe von CaCl2 und MgCl2 zum Vorinkubationsmedium und Matrigel® im Verhältnis 4 (Phosphatpuffer): 2 (CaCl2): 1 ausgeglichen (MgCl2). LY2090314 (Selleck) wurde in DMSO bei 10 mM als Stammlösung gelöst und auf 1 mM für ein Aliquot von 25 μl verdünnt. SC79 (Selleck) wurde als Stammlösung in DMSO bei 25 mM gelöst. Omipalisib (GSK2126458, GSK458, Selleck) wurde als Stammlösung in DMSO bei 5 mM gelöst. Cytochalasin D (Cayman Chemical) wurde in DMSO mit 1 mg/ml als Stammlösung gelöst. CalbryteTM−520L Kaliumsalz (20642, AAT Bioquest®) wurde in destilliertem Wasser bei 10 mM gelöst, das 1 mM CaCl2 enthielt. Nocodazol (FUJIFILM Wako) wurde in DMSO mit 10 mg/ml als Stammlösung gelöst.

Augenbecher wurden von E4-Küken isoliert. Die Linse und das Pigmentepithel wurden entfernt. Die gesamte neurale Netzhaut wurde 24 Stunden lang in DMEM mit 20 % FBS und 4 % Hühnerserum inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Netzhaut mit der Innenseite nach oben auf einem schwarzen Membranfilter oder auf dem Boden einer Aufnahmekammer mit einem Paar L-förmiger Wolframnadeln ausgebreitet.

Netzhautstreifen von E6-Küken wurden 48 Stunden lang kultiviert. Die ventrale Seite des Netzhautstreifens lag der offenen Seite eines fächerförmigen Mikrofluidikchips gegenüber (ergänzende Abbildung 3, SOKEN, Ome, Japan). Es wurde aus einer Acrylplatte (3,0 mm Breite, 2,0 mm Länge, 0,8 mm Dicke) hergestellt. Sein Öffnungswinkel betrug 160°. Der zentrale Kanal (0,2 mm breit, 0,5 mm tief) wurde in der Mitte für den Stromfluss gegraben. Es wurde in die Mulde (3,2 mm Breite) einer 1,0 mm dicken Kulturkammer gegeben. Alle Lücken wurden mit Silikonfett gefüllt, so dass der Strom allein durch den Kanal floss. Von einem Hochspannungsverstärker mit konstanter Ausgangsspannung (115 V) wurde über einen Widerstand (2, 20, 200 MΩ) ein konstanter Strom angelegt. Matrigel® und das Kulturmedium enthielten 20 % FBS und 4 % Hühnerserum. W1B10 (100 μg/ml) wurde dem Vorinkubationsmedium und Matrigel® zugesetzt, um die elektrischen Effekte zu verstärken.

Eine Kulturkammer mit einem Mikrokanal wurde aus einer Acrylscheibe (25,0 mm Durchmesser, 1,0 mm Dicke, SOKEN, Ome, Japan) hergestellt. Die Breite des Mikrokanals betrug 0,2 mm, die Länge und die Tiefe betrugen 1,0 mm (Ergänzende Abbildung 5a). Ein Strom wurde auf den Mikrokanal zwischen den bogenförmigen Wänden konzentriert, um zur Kathode zu fließen. Netzhautstreifen von E6-Küken wurden 48 Stunden lang kultiviert. Die Länge der ventralen Kante der Netzhautstreifen betrug 2,2 mm und die Breite 0,8–1,0 mm. Die ventrale Kante des Netzhautstreifens lag in einem Abstand von 0,4 mm zum Mikrokanal (ergänzende Abbildung 5b). Die nasalen und temporalen Ecken des ventralen Randes des Netzhautstreifens hatten Kontakt mit der bogenförmigen Wand der Mikrokanalkammer. Ein konstanter Strom wurde von einer Konstantstromquelle (GS200, Yokogawa) angelegt. Matrigel® und das Kulturmedium enthielten 20 % FBS und 4 % Hühnerserum. Der Konvergenzwinkel (CA) wurde mithilfe von ImageJ zwischen zwei Axonen gemessen, die sich gerade (≥ 100 μm) von den nasalsten und temporalsten Regionen des Netzhautstreifens in Richtung des Mikrokanals erstreckten. Sigmoid- oder gebogene Axone wurden nicht verwendet. Mit ImageJ wurden aus Original-TIF-Bildern Querprofile der Fluoreszenzintensitäten an der Halbabstandslinie zwischen der Netzhaut und dem Mikrokanal erstellt. Der minimale Wert der Fluoreszenzintensität wurde als Hintergrund abgezogen. FCA wurde aus der Gesamtsumme des Querprofils ermittelt. Fotos für CA- und FCA-Messungen wurden mit einem ×10-Objektiv auf der Ebene der RGC-Schicht aufgenommen.

Netzhautstreifen (~2,5 mm × 2,5 mm) wurden aus dem Segment 0,7 mm dorsal zum Sehnervenkopf der Netzhäute von E6-Hühnern auf einem schwarzen Membranfilter mit der Innenseite nach oben präpariert. Der Netzhautstreifen wurde in DMEM auf Eis gekühlt und zur konstanten EF-Kultur in die Kulturkammer überführt. Es wurde in 2,5 μl Matrigel® mit 20 % FBS und 4 % Hühnerserum eingeweicht. Die oberflächliche Schicht der Netzhaut wurde herausgekratzt und mit einem feinen Malpinsel, dessen Haarbündeldurchmesser 0,5 mm betrug (GH-BRSUP-GT, GodHand, Tsubame, Japan), auf dem Boden der Kammer verteilt. Die Kulturkammer wurde zum Gelieren 5 Minuten lang in eine befeuchtete Thermostatkammer bei 37 °C gestellt. Anschließend wurde es mit DMEM, das 20 % FBS und 4 % Hühnerserum enthielt, gefüllt und 24 Stunden lang inkubiert.

Die dünne Matrigel®-Schicht, die Zellmassen enthielt, wurde fünfmal mit einer ausgewogenen Hanks-Salzlösung, modifiziert ohne Ca2+, Mg2+ (H6648, Sigma-Aldrich), gewaschen. Eine Mikropipette wurde aus einer Borosilikatglaskapillare mit einem Filament (GC150F-10, Harvard Apparatus) unter Verwendung eines Abziehers (P-97, Sutter Instrument) hergestellt. Die Mikropipette wurde mit 10 mM CalbryteTM-520L (20642, AAT Bioquest®) gefüllt, das 1 mM CaCl2 enthielt, und wurde mithilfe eines piezoelektrischen Positionierungssystems (PCS-1000, Burleigh Instruments) manipuliert. Der Strom zur Lieferung von CalbryteTM−520L (−200 nA) wurde von einer Konstantstromquelle (GS200, Yokogawa) geliefert. Um einen EF von ~15 mV/mm anzuwenden, wurde ein konstanter Strom von 180 μA von einem Hochspannungsverstärker mit konstanter Ausgangsspannung (115 V) über einen variablen Widerstand (0,1–1,0 MΩ) mit einem Paar Polyethylenrohre geliefert Elektroden (Φ 1 mm) mit 1 % Agar-Kochsalzlösung.

Das konfokale Mikroskopsystem mit hoher Vergrößerung (ergänzende Abbildung 13) wurde für die Ca2+-Fluoreszenzaufzeichnung und Fluoreszenzbildgebung von Zytoskeletten verwendet. Es enthielt einen Bildverstärker (C9016-01, Hamamatsu) und eine Hochleistungslaserquelle (473 nm, 150 mW, 06-MLD, 0473-06-03-0150-100, Cobolt). Ca2+-Fluoreszenzbilder wurden mit einer Rate von 10 fps (Belichtungszeit: 100 ms) aufgenommen. Zur Erfassung und Analyse von Ca2+-Fluoreszenzbildern wurde die Software HCImage Live (Hamamatsu) verwendet. ImageJ wurde verwendet, um Querprofile zu erhalten und den Winkel von Axonen zu messen.

Das TubulinTrackerTM Green-Reagenz (Oregon GreenTM 488 Taxol, Bisacetat, T34075, Invitrogen) (Komponente A) wurde in 71 μl DMSO gelöst, um eine 1 mM Stammlösung herzustellen. Zehn Mikroliter Komponente A wurden mit 10 μl Komponente B (20 % Pluronic F-127 in DMSO) gemischt, um eine 500 μM Zwischenstammlösung herzustellen. Zehn Mikroliter der Zwischenstammlösung wurden in 10 ml DMEM (HEPES-gepuffert, ohne Phenolrot) gelöst, um eine 500 nM Arbeitslösung herzustellen. Netzhautstreifen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der Arbeitslösung gefärbt.

Es wurde Acti-stainTM 488 fluoreszierendes Phalloidin (PHDG1, Cytoskeleton) verwendet. Fünfzig Mikroliter des Reagenzes (14 μM) wurden in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, Nacalai Tesque) verdünnt, um eine 140 nM Arbeitslösung herzustellen. Netzhautstreifen wurden 10 Minuten lang in einer Fixierlösung (4 % Paraformaldehyd in PBS, Nacalai Tesque) fixiert und 5 Minuten lang in einem Permeabilisierungspuffer (0,05–0,1 % Triton X-100 in PBS) permeabilisiert. Anschließend wurden sie 30 Minuten lang mit der Arbeitslösung gefärbt. Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

Aus einer Netzhaut wurde ein Netzhautstreifen hergestellt. Die Anzahl der getesteten Netzhautstreifen entspricht der Anzahl unabhängiger Experimente. Sechs Fotos wurden von einem Netzhautstreifen aufgenommen und die Gesamtdaten mehrerer Netzhautstreifen wurden für jede Versuchsbedingung gemittelt. Auf alle statistischen Vergleiche wurde ein zweiseitiger T-Test angewendet. Statistisch signifikante Unterschiede wurden ausgewertet, wenn P < 0,001 (**) oder < 0,01 (*). Alle in dieser Studie vorgestellten experimentellen Ergebnisse waren reproduzierbar.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die numerischen Quelldaten für Abb. 1d, k, l, 2g, 3d–f, 4d–g, 5i, j, m sind in den Zusatzdaten 1 angegeben.

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Diese Arbeit wurde von der Japan Spina Bifida and Hydrocephalus Research Foundation (JSBHRF), der Eye Research Foundation for the Aged (ERFA), der Suzuken Memorial Foundation, der Naito Foundation, Novartis Alcon, JSPS KAKENHI JP25460298, JP18K06857, JP21K06772 unterstützt.

Internationale Universität für Gesundheit und Soziales, Ohtawara, Japan

Masayuki Yamashita

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MY war an der Konzeption und Durchführung der Forschung, an der Finanzierungseinwerbung, an der Analyse der Ergebnisse und am Verfassen des Manuskripts beteiligt.

Korrespondenz mit Masayuki Yamashita.

Der Autor gibt keine Interessenkonflikte an.

Communications Biology dankt Soumyajit Dutta und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Ivo Lieberam und George Inglis. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yamashita, M. Integrin-vermittelte elektrische Axonführung, die der Bildung des Sehnervs in der embryonalen Netzhaut von Küken zugrunde liegt. Commun Biol 6, 680 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05056-x

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Eingegangen: 08. September 2022

Angenommen: 20. Juni 2023

Veröffentlicht: 30. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05056-x

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